Молочнокислое брожение
Молочнокислое брожение, как и спиртовое, известно со времен глубокой древности. Со скисанием молока человек познакомился, вероятно, уже в самом начале развития скотоводства. Однако причина этого явления была установлена много позднее.
В 1857 г. Луи Пастер обнаружил в кислом молоке микробов, морфологически отличных от дрожжевых клеток. При дальнейшем изучении молочнокислого брожения он пришел к выводу, что действие микробов специфично, что брожение является энергетическим процессом - особой формой обмена веществ, проявляющейся у микроорганизмов в отсутствие кислорода воздуха и заменяющей им дыхание, свойственное высшим животным и растениям. Чистая культура молочнокислых бактерий, названная Streptococcus lactis, была выделена лишь спустя 20 лет, в 1877 г., Листером.
Молочнокислые бактерии очень широко распространены в природе. Их можно выделить из разнообразных пищевых продуктов, особенно молочных, а также обнаружить на поверхности овощей и фруктов. Встречаются молочнокислые бактерии также в воздухе, в почве, на кожных покровах и в кишечнике человека и животных.
Свойства микроорганизмов молочнокислого брожения чрезвычайно разнообразны. С результатами их жизнедеятельности мы постоянно встречаемся в практической жизни. Получение кисломолочных продуктов (простокваши, сметаны, творога, кефира, сыров, кумыса), сливочного масла, хлебного кваса, кислого хлебного теста, квашеных овощей (капусты, огурцов и пр.), приготовление моченых яблок, силосование кормов - все это процессы, связанные с биохимической деятельностью молочнокислых бактерий.
Химизм молочнокислого брожения
По характеру возбуждаемых биохимических реакций молочнокислые бактерии делятся на две группы: типичные (гомоферментативные) и нетипичные (гетероферментативные).
Типичные молочнокислые бактерии осуществляют гладкое расщепление сахаров до молочной кислоты без образования заметных количеств каких-либо побочных продуктов. Нетипичные же молочнокислые бактерии наряду с молочной кислотой всегда продуцируют большее или меньшее количество побочных продуктов - уксусной кислоты, янтарной кислоты, этилового спирта, углекислого газа и пр. Это обстоятельство свидетельствует о различии в сущности протекающих биохимических реакций. В самом общем виде процесс гомоферментативного молочнокислого брожения выражается очень простым уравнением:
При этом поэтапно распад моносахаридов идет с образованием тех же продуктов, что и при спиртовом брожении, вплоть до образования пировиноградной кислоты. Однако с момента образования пировиноградной кислоты механизм процесса изменяется: в комплексе ферментов у молочнокислых бактерий отсутствует карбоксилаза, в результате чего вместо расщепления пировиноградной кислоты на уксусный альдегид и углекислый газ она восстанавливается в молочную кислоту. Процесс восстановления пировиноградной кислоты в молочную катализируется ферментом редуктазой.
Для гетероферментативного молочнокислого брожения чаще всего приводят следующее схематическое уравнение:
Возникновение побочных продуктов брожения может быть объяснено тем, что микроорганизмы, вызывающие гетероферментативное молочнокислое брожение, в комплексе ферментов содержат карбоксилазу. Пировиноградная кислота расщепляется при этом до уксусного альдегида и CO2 лишь частично. В результате разнообразных превращений уксусного альдегида и пировиноградной кислоты и происходит возникновение янтарной, уксусной кислот и этилового спирта.
Таким образом, гетероферментативное молочнокислое брожение протекает более сложно, чем гомоферментативное. Количественные соотношения между накапливающимися побочными продуктами гетероферментативного молочнокислого брожения могут быть самыми различными: молочной кислоты может накопиться до 40% от количества сброженного сахара, янтарной кислоты - около 20%, этилового спирта и уксусной кислоты примерно поровну - по 10%, газов - около 20%. Иногда выход газов уменьшается, но тогда в среде появляется муравьиная кислота (HCOOH).
Общая характеристика молочнокислых бактерий
Молочнокислые бактерии отнесены к роду лактобактерий (Lactobacterium), так как это неспорообразующие палочки и кокки. В основном это неподвижные грамположительные формы. Большинство молочнокислых бактерий - факультативные анаэробы, однако все же лучше всего они развиваются без доступа кислорода. Сбраживающая способность у типичных молочнокислых бактерий по отношению к различным моно- и дисахаридам довольно высокая. Сбраживать же крахмал и другие полисахариды они не способны, так как в их ферментативном комплексе нет соответствующих гидролитических ферментов. К источникам азотистого питания типичные молочнокислые бактерии чрезвычайно требовательны. Для их развития необходимы некоторые аминокислоты или еще более сложные органические соединения азота (пептоны, полипептиды, растворимые белки). Нуждаются типичные молочнокислые бактерии и в некоторых витаминах, так как продуцировать их сами не в состоянии. Высокая чувствительность этих бактерий к отдельным аминокислотам и витаминам используется при аналитическом определении количественного содержания таких веществ в различных средах. Нетипичные молочнокислые бактерии к источникам азота менее требовательны и лучше развиваются в аэробных условиях.
Наиболее важные в техническом отношении молочнокислые бактерии следующие.
Типичные молочнокислые бактерии. Молочнокислый стрептококк (Streptococcus lactis) (рис. 22). Это небольшая, очень короткая палочка (1-1,5 х 0,5-1,0 мкм), вызывающая естественное скисание молока. В молодых культурах имеет вид типичного стрептококка. При росте на агаре образует мелкие (точечные) колонии с ровными гладкими краями. Факультативный анаэроб, хорошо сбраживает глюкозу, мальтозу, лактозу, образуя в среде до 0,8-1% молочной кислоты. Кардинальные температурные точки - минимум 10 °С, оптимум 30-35 °С, максимум 45 °С. При оптимальной температуре вызывает свертывание молока за 10-12 ч. Источником азота для молочнокислого стрептококка является пептон. Казеин и желатину этот микроб гидролизует слабо. Streptococcus lactis широко используется в молочной промышленности для получения разнообразных кисломолочных продуктов - творога, сметаны, простокваши, кислосливочного масла и пр.
Сливочный стрептококк (Streptococcus cremoris) (рис. 23). Особый вид молочнокислого стрептококка, образующий длинные цепочки. Клетки его сферической формы размером 0,6-0,7 мкм. Развивается при температурах несколько более низких, чем Streptococcus lactis: оптимум 25-30 °С, максимум 35-38 °С. Сбраживает глюкозу и лактозу. Сливочный стрептококк несколько более слабый кислотообразователь и дает продукты с более мягким вкусом. Применяется в заквасках вместе с молочнокислым стрептококком.
Болгарская палочка (Lactobacterium bulgaricum) (рис. 24). Выделена И. И. Мечниковым из болгарской простокваши. Это длинная неподвижная палочка (5-20 мкм). Сбраживает глюкозу и лактозу. Оптимальная температура развития 40-45 °С, минимальная 20 °С. Сильный кислотообразователь, может накапливать в молоке до 3,7% молочной кислоты. При развитии на агаре с молочной сывороткой образует колонии, напоминающие спутанные волокна ваты.
Ацидофильная палочка (Lactobacterium acidophilum) (рис. 25). Микроб выделен из кишечника грудных детей и молодняка животных (телят). Это длинная палочка (4-5 мкм), сбраживающая глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу. Довольно термофильна: оптимум развития ее 40 °С, минимум 20 °С. Способна накапливать до 2,2% молочной кислоты. Используется при изготовлении ацидофильного молока и ацидофильной простокваши.
Сырная палочка (Lactobacterium casei) (рис. 26). Сырная палочка представляет собой небольшую (2-6 х 0,7-0,9 мкм) палочку. В культурах она чаще встречается в виде более или менее длинных цепочек с ясно выраженной зернистостью клеток. Хорошо сбраживает глюкозу, лактозу, мальтозу. Сырная палочка весьма кислотоустойчива. Кардинальные температурные точки ее развития: минимум 22 С, оптимум 30 35 °С, максимум 55 °С. Темп развития этой молочнокислой бактерии довольно медленный - она вызывает сквашивание молока лишь на 3-5-е сутки. Однако благодаря наличию протеолитических ферментов сырная палочка легко расщепляет казеин до аминокислот. Этот процесс весьма важен в технологии изготовления сыров, поэтому эта бактерия находит широкое применение в сыроделии.
Дельбрюковская палочка (Lactobacterium delbriickii - Thermobacterium cereale) (рис. 27) - злаковая термофильная бактерия, часто встречается на зернах ячменя. Это тонкая палочка (2-7 х 0,4-0,8 мкм), способная при своем развитии в субстратах образовывать длинные нити - от 100 до 1000 мкм. Ее температурный оптимум 45-50 °С, минимум 18 °С, максимум 55 °С. Дельбрюковская палочка в отличие от других молочнокислых бактерий не сбраживает лактозу, поэтому в молочном деле она не используется. Но так как она энергично сбраживает глюкозу, сахарозу и мальтозу, то ее техническое значение очень велико. Дельбрюковскую палочку используют при получении молочной кислоты биологическим путем. В заторе, содержащем указанные сахара (брожение ведут с добавлением мела), может накапливаться молочной кислоты до 70% от количества содержащегося в субстрате сахара. Молочная кислота - важный технический продукт. Ее используют в текстильном производстве при протравном крашении, в кожевенном деле, в бродильных производствах (добавляется для предотвращения заражения посторонними бактериями), а также в фармакологии.
Огуречная палочка (Lactobacterium cucumeris fermentati) (рис. 28) чаще всего обнаруживается при сквашивании капусты, томатов, огурцов, ягод, различных фруктов, принимает участие при силосовании кормов. Это неподвижные грамположительные одиночные палочки, иногда соединенные попарно или цепочками. Больше всего цепочек образуется во время брожения. Клетки небольшие (3-8 х 0,3-1,0 мкм) с закругленными концами. При росте на сусловом агаре образует мелкие колонии, желатину не разжижает. Из углеводов сбраживает глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, раффинозу и маннит (без образования газов). Максимальное накопление молочной кислоты в субстрате не превышает 0,9-1,2%.
Огуречная палочка способна сбраживать пентозы, поэтому ее, как уже указывалось, всегда можно обнаружить и в силосе. Бактерия Lactobacterium plantarum, считающаяся основным возбудителем брожения при силосовании кормов, по-видимому, является разновидностью огуречной палочки.
Нетипичные молочнокислые бактерии. Капустная палочка (Lactobacterium brassicae fermentatae) является возбудителем молочнокислого брожения при квашении капусты. А1орфологически она очень сходна с огуречной палочкой, только несколько крупнее ее. Располагаются клетки капустной палочки в одиночку, парами и короткими цепочками, часто образуют длинные нити. Концы палочек закруглены; колонии капустной палочки, возникающие при развитии ее на сусловом агаре, очень похожи на колонии огуречной палочки.
При сбраживании сахаров капустная палочка образует молочную и уксусную кислоты, этиловый спирт (до 2,4%) и CO2. Сахарозу сбраживает энергичнее, чем лактозу. Молочной кислоты в рассолах может накапливаться до 1,2%. Одновременна с указанными продуктами капустная палочка при брожении способна образовывать и ароматические вещества, придающие сквашиваемому продукту приятный вкус и аромат.
Порчу томатов и томатного сока возбуждает еще одна бактерия - Lactobacterium lycopersici. Это - грамотрицательная газообразующая палочка. Клетки ее располагаются одиночно, парами и в виде цепочек. Интересно то, что Lactobacterium lycopersici способна развиваться как в аэробных, так и в факультативноанаэробных и даже анаэробных условиях. Плоды томатов Lactobacterium lycopersici поражает во время их роста, возбуждая вершинную гниль. Порчу цельноконсервированных томатов и томатного сока вызывает в том случае, если во время стерилизации был нарушен температурный режим. В консервах в этом случае сохраняются жизнеспособные клетки, сбраживающие углеводы и органические кислоты томатного сока. При этом образуется спирт, уксусная и молочная кислоты и CO2. В аэробных условиях Lactobacterium lycopersici способна развиваться и за счет других органических веществ.
При нормальном проведении технологического процесса порчи консервированных томатов и томатного сока не происходит, так как Lactobacterium lycopersici не образует спор, а ее вегетативные клетки погибают при температуре ниже 100 °С - в пределах 77-80 °С.
Гетероферментативное молочнокислое брожение способна возбуждать и кишечная палочка Escherichia coli и очень близкий к ней микроб Escherichia coli aёrogenes (или Aёrobacter aёrogenes). Общий характер брожения, возбуждаемого кишечной палочкой, можно выразить уравнением
Кроме того, в числе продуктов брожения могут быть обнаружены: метан, янтарная, пропионовая и муравьиная кислоты.
Так как кишечная палочка относится к категории так называемых условнопатогенных микробов, она подробно будет описана при микробиологическом анализе воды. Как возбудитель гетероферментативного молочнокислого брожения кишечная палочка может вызвать порчу пищевых продуктов (например, вспучивание сыров и пр.).