Распределительная хроматография

Распределительная хроматография основана на свойстве разделяемых компонентов различно распределяться между двумя несмешивающимися или слабосмешивающимися жидкими фазами. Одна из жидких фаз является неподвижной фазой, она прочно удерживается на поверхности твердого вещества - «носитетеля» - в виде мономолекулярного слоя жидкости. В другой фазе - подвижной - растворяют исследуемую смесь, нанесенную на носитель.

В процессе хроматографирования происходит перераспределение веществ смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Скорость передвижения отдельных компонентов различна, что обусловливает возможность выделения их из сложной смеси. В практике исследований наиболее широко распространен метод распределительной хроматографии на бумаге.

Распределительная хроматография на бумаге. Носителем при бумажной хроматографии служит воздушносухая фильтровальная бумага, а содержащаяся в ней гигроскопическая вода является неподвижной фазой. В качестве подвижной фазы применяют несмешивающиеся или частично смешивающиеся с водой органические растворители.

При получении хроматограмм по методу бумажной хроматографии на край полосы фильтровальной бумаги наносят каплю исследуемого раствора, затем полосу погружают в специально предназначенную для хроматографирования стеклянную ванночку, содержащую подвижный растворитель. При продвижении растворителя по бумаге отдельные компоненты смеси также перемещаются, но с различной скоростью, что обеспечивает разделение смеси.

Хроматограммы получают в герметических камерах в атмосфере, насыщенной парами органического растворителя и воды. Полученные хроматограммы высушивают и для проявления разделенных веществ опрыскивают (проявляют) реактивом, который образует окрашенные соединения с выделенными веществами, что позволяет определить расположение их на полосе бумаги. В определенных условиях опыта распределение отдельных веществ в обеих жидких фазах характеризуется постоянным коэффициентом Rf.

Коэффициент распределения Rf определяется отношением расстояния (в см), пройденного испытуемым раствором, к расстоянию (в см), пройденному растворителем. Воспроизводимость значений Rf зависит от условий проводимых исследований (качества бумаги, степени чистоты растворителей, температуры, состава газовой атмосферы и т.д.).

Различают несколько вариантов бумажной хроматографии: восходящая - растворитель движется снизу вверх, нисходящая - растворитель движется сверху вниз и радиальная (круговая) - растворитель движется от центра к окружности. Кроме того, применяют одномерную и двухмерную хроматографию; при одномерной хроматографии разделение веществ проводят в одном направлении, при двухмерной - в двух взаимно перпендикулярных направлениях.

Одномерная хроматография. Одномерная хроматография наиболее проста и применяется для исследования несложных смесей, для проверки чистоты вещества, для идентификации веществ.

При одномерной хроматографии методика определения заключается в следующем. На полосу хроматографической бумаги на расстоянии нескольких сантиметров от края наносят определенное количество исследуемого раствора. Бумагу помещают в ванночку с растворителем, находящуюся в камере, используя методику восходящей или нисходящей хроматографии (рис. 11). Растворитель при этом продвигается и, когда до конца остается примерно 2 см, процесс прекращают, хроматограмму вынимают из камеры, отмечают фронт растворителя и высушивают при температуре 100° С для удаления растворителя.

Хроматограмму проявляют обработкой специальным реактивом и по расположению образовавшихся цветных пятен на хроматограмме устанавливают Rf для определенного вещества, учитывая расстояние от исходной точки нанесения раствора до середины соответствующего пятна. Затем по специальным таблицам можно определить, какому веществу (например, какой аминокислоте) соответствует пятно. Обычно для идентификации веществ используют одновременно полученную хроматограмму известных веществ - «свидетелей». По совпадению расположения пятен этих хроматограмм устанавливают идентичность веществ.

Двухмерная хроматография. Двухмерную хроматографию применяют для разделения сложных смесей, например для характеристики аминокислот, получаемых при гидролизе белков. Этот хроматографический метод заключается в том, что разделение веществ проводят в два приема, двумя растворителями во взаимно перпендикулярных направлениях.

Радиальная (круговая) хроматография. Для радиальной хроматографии применяют круглые фильтры, которые делят простым карандашом на ряд одинаковых по размеру секторов и проводят две окружности - одну на расстоянии 1 - 1,5 см от центра и вторую на расстоянии 5 см. На линию первой окружности (стартовой) в каждом секторе наносят капли исследуемого раствора, а вторая окружность является границей хроматограммы. В центре бумажного диска делают отверстие, вставляют бумажный фитиль, который погружают в растворитель.

Поднимаясь по бумажному фитилю, растворитель переходит на бумажный диск и, распространяясь по бумаге, переносит компоненты, находящиеся в капле, от центра к окружности. В качестве камер применяют чашки Петри с высокими бортами. Радиальная хроматография является наиболее простым и быстрым методом хроматографического разделения веществ. При этом методе достигается высокий эффект разделения.

При количественном анализе методом бумажной хроматографии на бумагу наносят определенный объем исследуемого раствора. Если анализируют растворы с небольшой концентрацией исследуемых веществ, то капли наносят несколько раз, каждый раз подсушивая нанесенное пятно, затем проводят хроматографическое разделение.

Для количественного определения выделенных веществ пользуются следующим приемом. Из полученной хроматограммы вырезают участок, содержащий выделенное вещество, элюируют его растворителем и определяют его концентрацию при помощи спектрофотометра или фотоэлектроколориметра.