Определение содержания азотистых веществ

Среди азотистых веществ, содержащихся в растительных продуктах, главное место принадлежит белкам. Поэтому содержание белков в растительных продуктах часто определяют на основании найденного в продукте общего количества азота; при пересчете азота на белок исследуемого продукта учитывают процентное содержание азота в белке данного продукта.

Так, например, если азот составляет 16% белка продукта, то для пересчета найденного количества азота на белок нужно количество азота умножить на 100: 16 = 6,25. В этом случае пересчетным коэффициентом является число 6,25. Этим числом пользуются при определении содержания белков в ячмене и в кормовых дрожжах.

Указанный способ расчета белка по количеству азота дает представление о содержании в продуктах не чистого белка, а так называемого «сырого протеина», так как вместе с азотом белка одновременно определяют азот и других соединений (пептидов, аминокислот, амидов и других). Наиболее распространенным методом определения содержания азота является метод Кьельдаля.

Принцип этого метода состоит в том, что исследуемый материал подвергают окислению крепкой серной кислотой при нагревании. Серная кислота раскисляется до сернистого газа и окисляет углерод исследуемого материала до углекислого газа, водород - до воды, а азот восстанавливает в аммиак. Образовавшийся аммиак связывается с избытком серной кислоты в сернокислый аммоний. Последний разлагают раствором щелочи, при этом освобождается аммиак и его количественно определяют титрованным раствором кислоты. По количеству аммиака вычисляют количество белков.

Ход определения

Навеску исследуемого материала помещают в длинногорлую круглодонную колбу из тугоплавкого стекла (колбу Кьельдаля). В эту же колбу вливают х.ч. концентрированную серную кислоту относительной плотностью 1,835 (столько, чтобы на каждый грамм сухого вещества навески приходилось не менее 10 мл кислоты). При внесении навески в колбу наблюдают, чтобы частицы исследуемого материала не прилипли к горлышку колбы; если это все же случилось, то прилипшие частицы смывают при вливании серной кислоты, в противном случае они не будут сожжены. В колбу Кьельдаля, кроме серной кислоты, прибавляют сернокислый калий (1-1,5 г на каждые 10 мл серной кислоты) и немного окиси меди. Окись меди прибавляют как катализатор, ускоряющий реакцию окисления органических веществ; прибавление сернокислого калия повышает температуру кипения серной кислоты, что также ускоряет сжигание.

Полученную смесь осторожно нагревают в вытяжном шкафу на слабом огне до тех пор, пока она не перестанет вспучиваться вследствие выделения газообразных продуктов реакции, при этом следят, чтобы содержимое колбы не выбросило из нее. После прекращения вспучивания нагревание усиливают так, чтобы серная кислота непрерывно кипела. Для кипячения колбу ставят в наклонное положение, чтобы ее длинное горло не нагревалось.

Длинное горло колбы служит воздушным холодильником; без него серная кислота быстро бы выпарилась. Поэтому и кипение кислоты не должно быть слишком бурным, чтобы пары ее успевали конденсироваться в горле колбы. При кипячении должна улетучиваться не серная кислота, а только продукты сжигания - Н2O, CO2 и SO2.

Сжигание навески ведут до полного осветления содержимого колбы. Если на стеклах колбы осели обугленные частички, то их следует смыть горячей смесью, осторожно поворачивая колбу. Затем осветленную жидкость подвергают дополнительному нагреванию в течение 1-2 ч. После полного сжигания колбу Кьельдаля охлаждают и добавляют в нее немного воды. Полученный раствор количественно переносят в перегонную колбу емкостью 500 мл; колбу Кьельдаля 3-4 раза ополаскивают водой в количестве около 200 мл, которую также выливают в перегонную колбу. Затем собирают прибор для перегонки (рис. 46): перегонную колбу с помощью каплеуловителя соединяют с холодильником; к другому концу холодильника присоединяют отводную трубку, конец которой погружают в коническую колбу на 200 мл, куда наливают 25 мл 0,1 н. раствора серной или соляной кислоты.

При уменьшении нагревания часть кислоты из приемной колбы может затянуть в холодильник и в перегонную колбу. Для предупреждения этого присоединяемая к холодильнику отводная трубка должна иметь расширение. Когда прибор собран, в перегонную колбу добавляют для предотвращения толчков при кипении стеклянные бусы или кусочки пемзы, бросают кусочки красной лакмусовой бумаги, приливают 30-35%-ный раствор едкого натра до щелочной реакции (лакмусовая бумажка синеет). После этого перегонную колбу немедленно, во избежание потерь аммиака, присоединяют к прибору и начинают нагревание.

Пары из колбы поступают сначала в каплеуловитель, чтобы брызги щелочной жидкости, кипящей в колбе, не попали в приемную колбу. Аммиак и конденсирующиеся в холодильнике водяные пары поступают в приемную колбу с 0,1 н. раствором серной кислоты, которая связывает аммиак в сернокислый аммоний. Перегонка обычно продолжается 45-60 мин. Конец перегонки определяют по реакции дистиллята: если капля его не дает посинения красной лакмусовой бумаги, то перегонку прекращают. По окончании перегонки отводную трубку, не вынимая из колбы, ополаскивают небольшим количеством воды, вынимают отводную трубку из колбы, прибавляют в колбу 3-5 капель метилкрасного и титруют 0,1 н. раствором едкого натра до изменения окраски.

Рекомендуется вместо метилкрасного применять смешанный индикатор - бромкрезолзеленый и метилкрасный; индикатор дает в кислой среде вишнево-красное окрашивание, в нейтральной - серое, в щелочной - зеленое.

Содержание азота в процентах (N) вычисляют по формуле

где а - количество 0,1 н. раствора H2SO4 в приемной колбе, мл; б - количество 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование избытка раствора серной кислоты, мл; в - взятая навеска исследуемого материала, г; 0,0014 - количество азота, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора серной кислоты.

Можно улавливать аммиак в приемной колбе 2%-ным раствором борной кислоты вместо 0,1 н. раствора H2SO4. При этом образуется аммонийная соль борной кислоты, которую оттитровывают 0,1 н. раствором серной кислоты. Таким образом устраняется обратное титрование и вместо двух титрованных растворов (NaOH и H2SO4) применяют только 0,1 н. раствор H2SO4.

Определение содержания белка в ячмене

Из среднего образца ячменя выделяют 30-50 г зерна, очищают его от сорной примеси (испорченные зерна ячменя оставляют), размалывают на лабораторной мельнице так, чтобы все размолотое зерно прошло при просеивании через проволочную сетку с размером ячеек 0,8 мм (№08). Размолотое зерно переносят на стеклянную пластинку размером 20X20 см, тщательно перемешивают, распределяют тонким слоем и придавливают другим стеклом такого же размера так, чтобы слой под стеклом получился не толще 3-4 мм. Снимают верхнее стекло и отбирают маленьким совочком не менее чем из 10 разных мест слоя порции размолотого зерна (около 1 г) в сухую узкую длинную пробирку, которая должна свободно входить в шейку колбы Кьельдаля.

Пробирку с содержимым взвешивают на аналитических весах и, вставив ее возможно глубже в колбу Кьельдаля во избежание распыления размолотого зерна по стенкам шейки колбы высыпают в колбу размолотое зерно. Пробирку с остатками размолотого зерна осторожно вынимают из колбы и вновь взвешивают. По разности между результатами первого и второго взвешиваний определяют величину навески. В колбу вливают 20 мл х. ч. серной кислоты, добавляют 1 г сернокислой меди и 10 г сернокислого калия. Далее определение ведут, как описано выше.

На каждую партию применяемых реактивов следует провести холостое определение, т.е. провести все указанные выше операции, но без навески исследуемого ячменя, и полученную при этом поправку вносить в расчет азота (белка) по основному определению.

Определение содержания белка в кормовых дрожжах

В кормовых дрожжах определяют содержание общего и истинного белка. Общий белок определяют по содержанию в дрожжах общего азота, которое умножают на коэффициент 6,25. Навеску дрожжей 1-2 г, отвешенную в бюксе на аналитических весах, переносят в колбу Кьельдаля. Взвешивают бюкс с остатком дрожжей и по разности определяют величину навески. В колбу добавляют 20 мл х. ч. серной кислоты, 0,5 г сернокислой меди и 5 г сернокислого калия. Содержимое колбы перемешивают, сжигают и далее поступают так, как описано выше.

Для определения содержания истинного белка в стакане емкостью 200-250 мл отвешивают 1-2 г дрожжей, обливают их 50 мл горячей воды, нагревают до кипения. Для осаждения белка прибавляют 20 мл 10%-ного раствора сернокислой меди и 20 мл 2,5%-ного раствора NaOH, хорошо перемешивают и после отстаивания в течение 60 мин осветленную жидкость, содержащую избыток меди, сливают через фильтр, а осадок (с декантацией) переносят на тот же фильтр и еще 2-3 раза промывают горячей водой. Воронку с фильтром и осадком немного подсушивают в сушильном шкафу, затем фильтр с осадком переносят в колбу Кьельдаля и после сжигания определяют азот, как описано выше. Количество азота в осадке, умноженное на 6,25, соответствует содержанию в дрожжах истинного белка.