Методы бактериологического исследования сырья и полуфабрикатов
Одним из основных условий производства высококачественных консервов является свежесть употребляемого сырья, поэтому во время приемки сырья на завод очень важно быстро и правильно определить его качество. Повседневный контроль качества сырья основан на определении его доброкачественности по органолептическим признакам.
Органолептический способ определения качества сырья является самым простым и распространенным на практике. Он позволяет на основании целого ряда положительных и отрицательных признаков, устанавливаемых по вкусу, цвету, запаху и консистенции, судить о свежести данного сырья.
Но одного органолептического определения свежести сырья в консервном производстве бывает недостаточно и требуется определение бактериальной обсемененности сырья. Так, для мясного и рыбного сырья в сомнительных случаях бактериальная обсемененность будет свидетельствовать о его свежести и предопределит режим перевозки, условий хранения и последующей переработки.
Наиболее точный и простой способ определения микроорганизмов на твердых пищевых продуктах заключается в том, что определенно взятую навеску исследуемого сырья обмывают соответствующим количеством стерильной воды с последующим определением количества микроорганизмов, попавших в эту воду при смывании. При проведении анализа необходимо отобрать среднюю пробу продукта.
Отбор проб
Перед отбором проб нужно иметь полное представление о всей партии продуктов, подлежащих исследованию. Для этого сырье, полуфабрикаты и прочие продукты подвергают внешнему осмотру. Одновременно производят отбор пробы в предварительно взвешенную и простерилизованную консервную стеклянную банку емкостью 1-1,5 л.
Банки, взятые для отбора проб, перед стерилизацией накрывают жестяными крышками, обертывают бумагой и обвязывают шпагатом. Ножи, пинцеты, ложки, которыми пользуются при отборе проб, также должны быть стерильными.
При обследовании мясных туш на бактериальную обсемененность из разных мест туши стерильным ножом вырезают кусочки мяса, придерживая их стерильным же пинцетом. Затем отрезанные кусочки мяса с помощью пинцета переносят в подготовленную банку. Если необходимо проверить обсемененность мяса после обвалки или жиловки, пробу отбирают от отдельных частей или кусков туши. При анализе мелкой рыбы пробу составляют из мелких рыбок, а от крупной рыбы отрезают кусочки (как при отборе проб от туш животных).
При анализе овощей и фруктов их отбирают пинцетом или ложкой из отдельных ящиков с сырьем, с конвейеров, столов, элеваторов и т.д. в каждой точке технологической линии (после мойки, при сортировке, при укладке в банки и пр.). Из ящиков плоды отбирают равными частями - сверху, из середины и из самого низа ящика. Рекомендуется отбирать плоды средней величины, чтобы в каждой пробе было не менее 7-10 плодов.
Если исследуемые овощи и фрукты крупного размера, их разрезают на части стерильным ножом. При отборе плодов с конвейеров и элеваторов (во время перемещения их от одной операции к другой) их берут непосредственно из потока равными частями через каждые 1-1,5 мин с таким расчетом, чтобы вся проба была отобрана за 8-10 мин. Навеска пробы (для всех видов сырья) колеблется от 100 до 400 г.
Чистая масса (вес) пробы определяется в лаборатории по разности масс (весов) банки с продуктом и пустой банки. Затем s банку с отобранной пробой наливают стерильную воду в отношении приблизительно 1:1 или 1:2, но обязательно так, чтобы поверхность продукта была полностью покрыта водой. Воду следует заранее простерилизовать. Отмеряют воду мерным стерильным цилиндром.
После 5-минутного встряхивания пробы с влитой водой (для обмывания поверхности продукта) приступают к посеву в чашки Петри. Встряхивание нужно проводить осторожно, не разливая смывной воды.
В консервном производстве применяется общий для всех видов консервов чашечный метод количественного учета микроорганизмов. Этот метод очень удобен, так как при проведении исследования образцов можно не только выявить общую бактериальную обсемененность, но и провести определение качественного состава микрофлоры продукта в одной и той же отобранной пробе. В зависимости от целей микробиологического контроля параллельно выявляют в данной партии наличие термофильных аэробов, факультативных анаэробных микробов и облигатных анаэробов.
Методика посева и выращивания колоний микроорганизмов чашечным методом
В зависимости от количества образцов, взятых для анализа, заготовляется необходимое количество стерильных чашек Петри и пробирок со стерильной питательной средой, разлитой на «высокий столбик». Если отобрано пять проб продукта, то при определении общей бактериальной обсемененности нужно иметь пять чашек и пять пробирок с питательной средой. При одновременном исследовании на присутствие термофильных аэробов, облигатных анаэробов и пр. количество чашек Петри соответственно увеличивают (по одной на каждый анализ) и при посеве используют питательную среду (например, дифференциально-диагностическую), нужную для выявляемого микроорганизма.
Для плесневых и дрожжевых грибов питательной средой служит сусловый агар. При определении общей бактериальной обсемененности и выявлении облигатных анаэробов используют мясопептонный агар. Термофилы выявляют используя мясопептонный агар с бромкрезолпурпуром.
Для выявления спорообразующей микрофлоры посевной материал перед высевом в чашки Петри прогревают на водяной бане при температуре 80-100°С. Чашечный метод количественного учета микроорганизмов заключается в том, что 1 мл исследуемого продукта или его разведения высевают в чашку Петри и заливают расплавленным и охлажденным до 45°С стерильным питательным агаром. Посев выращивают при соответствующей температуре и производят подсчет колоний.
Исследуемые материалы, за редким исключением, содержат такое количество микробов, что подсчитать их колонии, выросшие на чашке, если посев сделан без предварительного разведения, просто невозможно. Поэтому перед посевом такие материалы разводят стерильной водой, производя разбавление в 10, 100 раз и более. Разведение не производится в тех случаях, когда в 1 мл или в 1 г материала содержится не более 200-300 зародышей. Для разведения исследуемых материалов необходимо иметь в достаточном количестве стерильные пипетки (емкостью 1 мл) и стерильную воду в пробирках по 9 мл. Техника разведения описана выше (см. раздел «Обращение с бактериальными культурами и методы посева на питательные среды»).
Засеянные чашки Петри после застывания агара помещают (вверх дном) в термостат на 24-48 ч при температуре 37°С. Плесени и дрожжи выращивают при температуре 20-30 °С в течение 3-6 дней. Посевы для выявления термофилов инкубируют при 55 °С в течение 48 ч. После термостатирования подсчет выросших на чашке колоний производят, пользуясь лупой и рассматривая чашку со стороны дна. При наличии небольшого числа колоний (не более 100) их подсчитывают на площади всей чашки, отмечая сосчитанные колонии на стекле чернилами. Если колоний выросло больше (200-300), то для удобства подсчета дно чашки делят восковым карандашом (или чернилами) на секторы и подсчитывают число колоний в каждом секторе отдельно, а затем суммируют.
Умножая общее число выросших на чашке колоний на разведение, получают количество микробов в 1 мл посевного материала. Подсчет большого числа колоний на чашках Петри значительно облегчается, если использовать счетную камеру Вольфгюгеля (рис. 70). Эта камера представляет собой стеклянную пластинку, разделенную на 144 квадрата, каждый площадью 1 см2. Квадраты, расположенные по диагонали пластинки, разделены еще на девять мелких. Для подсчета колоний чашку Петри помещают на подставку счетной камеры дном вверх, а стекло камеры накладывают на дно чашки так, чтобы центр чашки совпадал с центром сетки на стекле. Затем подсчитывают число колоний на площади 10-12 квадратов, расположенных в разных местах чашки. Результаты, полученные при подсчете отдельных квадратов, суммируют и определяют среднее арифметическое из числа колоний, приходящееся на один квадрат (т.е. 1 см2). Пересчитывают на всю площадь чашки Петри с учетом разведения, получая количество микробов в 1 мл посевного материала.
Пример. На чашке из четвертого разведения в 10 квадратах счетной» камеры Вольфгюгеля выросло 90 колоний. Среднее арифметическое на 1 квадрат равно 9. Площадь чашки при диаметре 10 см равна пr2, или 3,14*5*5 = 78,5 см2. Следовательно, на всей чашке выросло: 9 * 78,5 = 706 колоний. Умножая это число на 10 000 (четвертое разведение), получаем 7 060 000 колоний в 1 мл исследуемого материала.
При расчете количества микроорганизмов на 1 г исследуемого продукта число колоний, выросших на чашке Петри, умножают на количество миллилитров взятой для смыва стерильной воды и делят на массу пробы в граммах. Если посев производился с разведением, умножают на степень разведения.
Метод смыва тампоном
При обследовании больших объектов, например крупной рыбы или туши животного, в некоторых случаях применяют метод смыва тампоном. Для анализа в этом случае нужно иметь шаблон - квадратную рамку из алюминия или луженой жести, применяемой для изготовления жестяной консервной тары. Внутренний квадратный вырез рамки может иметь площадь 9 см2 (3х3) или 4 см2 (2x2); для удобства пользования шаблоном к нему припаивают ручку из металлического прутка. Заготовляют стерильные тампоны (или салфетки). Простерилизованный шаблон-квадрат (его можно простерилизовать опусканием в спирт с последующим обжигом над пламенем горелки или небольшим кусочком смоченной спиртом ваты) прикладывают к одной из боковых поверхностей исследуемого объекта. Затем одной стороной тампона тщательно протирают в одном направлении ограниченную внутренним вырезом квадрата площадь (тампоны из посуды, в которой их стерилизовали, вынимают стерильным пинцетом). Перевернув тампон другой стороной, вытирают поверхность объекта в противоположном направлении и, наконец, поставив тампон перпендикулярно к исследуемой поверхности, обводят его концом ободок внутри квадрата. Если поверхность исследуемого объекта сухая, тампон смачивают предварительно в пробирке со стерильной водой. В случае если поверхность влажная или мокрая, смачивание тампона необязательно. После взятия пробы тампон помещают в колбочку (или пробирку) с определенным количеством стерильной воды. Вторым сухим тампоном ту же площадь вновь вытирают и помещают этот второй тампон в ту же колбу. Тампоны в колбочке осторожно взбалтывают в течение 5 мин. Посев в чашки производят в количестве 1 мл смывной воды, заливая расплавленным и охлажденным до 45 °С питательным агаром. Дальнейшее термостатирование и подсчет колоний ведут, как описано выше. Количество микроорганизмов рассчитывается на 1 см2 поверхности исследуемого объекта.
Приготовление препаратов-отпечатков при бактериоскопическом исследовании мясного сырья
Для определения свежести мяса, кроме органолептической оценки, проводят бактериоскопическое исследование, дающее возможность быстро определить степень обсемененности мяса микробами и установить его доброкачественность. При бактериоскопическом исследовании делают препарат-отпечаток на предметном стекле с поверхности и из глубины мышц.
При взятии отпечатка из глубины поверхность мяса прижигают раскаленным на пламени спиртовки ножом и стерильными ножницами и пинцетом вырезают кусочек мяса на глубине 2,5-3,5 см. Вырезанным небольшим кусочком делают мазок на стерильном предметном стекле. Препарат-отпечаток с поверхности мяса делают без прижигания: стерильное предметное стекло прикладывают к исследуемой поверхности мяса. Полученные мазки высушивают, фиксируют и окрашивают по Граму. При окраске по Граму выявляется при микроскопировании обсемененность мяса грамотрицательными микроорганизмами группы кишечной палочки и протея.
На основании бактериоскопического исследования устанавливаются следующие признаки свежести мяса:
Для несвежего мяса характерны следующие признаки, которыми пользуются при его органолептической оценке:
1) поверхность туши сильно подсохшая или, наоборот, липкая и покрыта плесенью;
2) цвет поверхности мяса серый или зеленоватый, на разрезе - темный;
3) мясо на разрезе дряблое, ямки при надавливании пальцами не выравниваются;
4) в глубоких слоях мускульной ткани ощущается явно гнилостный запах;
5) жир серый с грязноватым оттенком, иногда покрытый плесенью; поверхность слизистая; запах жира прогорклый или резко сальный.
В том случае, когда мясо имеет признаки недостаточно свежего продукта, необходимо сделать пробную варку. Пробная варка мяса производится в воде в закрытой кастрюле. Если мясо несвежее, то при кипячении появится явно неприятный, гнилостный запах, легко ощущаемый в момент образования паров при снятии крышки с посуды, в которой производят варку. Бульон при варке несвежего мяса получается грязного цвета с хлопьями, запах также гнилостный, затхлый, жировых капель на бульоне нет.
Приготовление препаратов-отпечатков при бактериоскопическом исследовании рыбного сырья
Во время приемки рыбы на завод очень важно быстро и правильно определить ее качество, так как одним из основных условий производства высококачественных рыбных консервов является свежесть употребляемого рыбного сырья. Доброкачественность рыбы определяется по органолептическим признакам, а в случае необходимости делается бактериоскопическое исследование.
Микробиологический анализ рыбы производится в тех случаях, когда имеется расхождение мнений в оценке или когда поступившая рыба имеет по качеству сомнительные органолептические данные. Для бактериоскопического исследования, так же как и при исследовании мяса, приготовляют препараты-отпечатки на стерильных предметных стеклах из глубины мышц рыбы и с ее поверхности.
При взятии отпечатка из глубины мышц кожу посредине спины рыбы освобождают от чешуи стерильным ножом и прижигают лезвием, раскалив его на пламени спиртовки. Стерильными ножницами и пинцетом из мышц на глубине 1-1,5 см вырезают кусочек мяса, которым и делают отпечаток на стерильном предметном стекле. Отпечаток с поверхности рыбы делают без прижигания, просто прикладывая стерильное предметное стекло к исследуемому месту поверхности рыбы.
Приготовленные отпечатки высушивают, осторожно фиксируют и окрашивают по Граму с целью выявления грамотрицательных бактерий группы кишечной палочки и протея. Одновременно при микроскопировании следует отметить форму и количество бактерий. Отпечаток, сделанный с поверхности рыбы, часто содержит округлые темные зерна пигмента. Их не следует смешивать с кокками.