Выделение конечного продукта
После стадии культивирования микроорганизма-продуцента следующим технологическим этапом является выделение и очистка конечного продукта из культуральной жидкости. Для многих микробиологических производств эта стадия начинается с разделения двух фаз, так как конечный продукт может содержаться либо в нативном растворе, либо в микробной массе.
Процесс выделения и очистки представляет собой ряд последовательных технологических операций, количество которых возрастает с повышением желаемой чистоты конечного продукта. Большая лабильность многих продуктов микробиологического синтеза, возможные потери их активности на стадии выделения и очистки привели к преимущественному использованию приемов разделения, которые не сопровождаются резкими химическими воздействиями на выделяемое вещество.
Выделение конечного продукта из культуральной жидкости
Большинство микроорганизмов-продуцентов биологически активных веществ накапливают основную часть синтезируемых ими продуктов в культуральной жидкости.
Культуральная жидкость представляет собой сложную многофазную систему, содержащую (от 1 до 5% и более сухого вещества) отдельные микробные клетки или мицелий, продукты биосинтеза и остатки питательной среды. Как правило, выделение конечного продукта из такой сложной смеси связано с определенными трудностями и в основном зависит от предварительной очистки нативного раствора.
Первой стадией подготовки культуральной жидкости для дальнейшей переработки является отделение взвешенной фазы - или микробной массы, в состав которой входят в основном непосредственно микроорганизмы, продукты их жизнедеятельности, а также остатки неиспользованной питательной среды. Свойства микробной массы неидентичны свойствам соответствующей чистой культуры микроорганизма.
В производственных условиях технологическая стадия отделения микробной массы от культуральной жидкости связана с обработкой больших объемов труднофильтруемых суспензий и потерями основного конечного продукта. Для улучшения фильтруемости и повышения качества фильтратов - нативных растворов с целью упрощения выделения и очистки получаемых продуктов проводится предварительная обработка культуральной жидкости электролитами, тепловая и кислотная коагуляция, фильтрующими порошками, флокулянтами и др.
Для выделения и очистки метаболитов применяются экстракционные и ионообменные методы. Отличительная особенность всех этих методов - большое число технологических стадий: фильтрация культуральной жидкости, концентрирование полученных растворов, экстрагирование целевого продукта, кристаллизация и т. п. Выбор конкретного метода в каждом случае будет зависеть от природы выделяемого продукта, его стабильности к различным внешним воздействиям, а также от требуемой избирательности процесса в связи с наличием других продуктов в нативном растворе.
Для отделения микробной массы от культуральной жидкости применяют фильтр-прессы, сепараторы, вакуум-фильтры, центрифуги различной производительности (рис. 2.20-2.23).
Как уже отмечалось, культуральная жидкость, отделенная от микробной массы, содержит продукты биосинтеза, органические и неорганические соединения, в том числе белки в растворенном и коллоидном состояниях. Культуральную жидкость следует рассматривать как коллоидную систему, коагуляцию части балластных веществ который можно вызвать добавлением различных электролитов, изменениями температуры, механическими воздействиями и т. д.
Так, при выделении некоторых антибиотиков балластные белки нативного раствора сначала коагулируют, а затем отделяют фильтрацией или центрифугированием. Если при сепарировании в растворе остается до 50-70% неотделившейся взвеси, то фильтрация позволяет полностью отделить примеси.
В последнее время для выделения, очистки и фракционирования физиологически активных веществ широко используются полимерные соединения - флокулянты. Они позволяют проводить предварительную очистку культуральных жидкостей в более мягких условиях по сравнению с обработкой неорганическими электролитами или тепловой обработкой. В производстве антибиотиков в результате применения флокулянтов на 40-45% уменьшается содержание белка в растворе, в 2-2,5 раза снижается его пигментация, увеличивается выход антибиотика (например, для неомицина на 10-12%). При обработке культуральной жидкости флокулянтами исключается применение хлорида кальция, на 15-20% сокращается расход тринатрий-фосфата.
При выделении ферментных препаратов к стадии предварительной обработки культуральной жидкости относится процесс осаждения нуклеиновых кислот. Они повышают вязкость обрабатываемых растворов, а также затрудняют фракционирование белка. Термообработка суспензии разрушенных дрожжей при температуре 50° С в течение 20 мин приводит к удалению до 85% нуклеиновых кислот. Их можно осаждать также неорганическими солями. Например, добавление к суспензии разрушенных (дезинтегрированных) клеток Acetobacter suboxydans 0,1 М раствора сернокислого марганца с последующим перемешиванием в течение 10-12 мин способствует удалению в осадок от 50 до 64 % нуклеиновых кислот.
Схема получения продуктов микробиологического синтеза и последовательность стадий обработки культуральной жидкости приведены ниже.
Выделение конечного продукта из микробной массы
Для извлечения внутриклеточных биополимеров - белков, нуклеиновых кислот, ферментов, липидов - широко используется метод дезинтеграции. Дезинтеграция, или разрушение, клеточных оболочек микроорганизмов осуществляется несколькими способами: химическими, биологическими, физическими (механическими).
Химические способы дезинтеграции. Основаны на деструкции упорядоченных структур клеточной стенки микроорганизмов. В результате сильного увеличения проницаемости клеточной стенки биополимеры с большой молекулярной массой выводятся через барьеры. Наиболее известные химические способы: обработка клеточной суспензии непосредственно щелочью, мочевиной, глицерином, аммиаком, перекисью водорода. Химические способы предназначены в основном для выделения суммарных белков пищевого назначения и не нашли широкого распространения в микробиологической промышленности. Последнее объясняется, вероятно, нежелательными эффектами, возникающими при химической дезинтеграции. Так, при обработке суспензии клеток микроорганизмов щелочью в определенных условиях образуется лизин-аланин, или лантионин, из-за чего снижаются количество доступного лизина и питательная ценность получаемого белка.
Биологические способы. Относятся к наиболее мягким способам разрушения клеточной оболочки и выделения внутриклеточных метаболитов. В качестве примера можно привести автолиз клеток или расщепление клеточной стенки при помощи литических ферментов. Автолиз клеток под действием внутриклеточных гидролитических ферментов проводится в кислой среде при температуре 30-35 °С в течение нескольких часов или суток с добавлением различных бактерицидных веществ. В результате получают смесь продуктов гидролиза - аминокислоты, пептиды, полипептиды и др. Процесс автолиза дрожжей осуществлен в промышленных условиях на установке мощностью 800 т в год пищевого белкового экстракта.
Литические ферменты, содержащие B-глюконазы, растворяют клетки дрожжей, микроскопических грибов, грамотрицательных и грамположительных бактерий. Лизис клеточной стенки микроорганизмов способствует увеличению перевариваемости микробной массы животными и выделению белков для пищевых целей.
С помощью иммобилизованных на коллагеновых пленках лизирующих ферментов из Streptorayces sp. можно разрушить клеточные стенки высушенных и интактных живых кормовых, хлебопекарных и пивных дрожжей. Развитие методов ферментативной дезинтеграции сдерживается сравнительно высокой стоимостью ферментных препаратов и отсутствием высокоочищенных литических ферментов.
Ферментативные реакции обычно осуществляются в специальных реакторах с рабочей поверхностью 120 и 1800 см2. Полученные дезинтеграты освобождают от оболочек разрушенных клеток и от неразрушенных клеток, а осветленный раствор обрабатывают так же, как культуральную жидкость.
Физические способы. Физическая дезинтеграция - это процесс, происходящий при высоких скоростях и сопровождающийся быстрым перемещением разрушаемого материала в зоне действия дезинтегрирующих сил. Физическую дезинтеграцию можно проводить в непрерывном режиме с автоматизацией процесса. Наиболее известные способы разрушения биологического материала - замораживание и оттаивание, ультразвуковые воздействия, истирание клеток, экструзия и др.
При использовании некоторых из способов, основанных на воздействии ультразвуковых колебаний, экструзии, декомпрессии, созданы установки, которые применяются в практике для дезинтеграции различных видов микроорганизмов. Например, установки Муллард и Биосония (ультразвук), пресс Хьюза и Френч-пресс (экструзия), дезинтегратор Микля и Брауна (встряхивание со стеклянными бусами), а также «азотная бомба» (декомпрессия).