Производственное культивирование микроорганизмов
Оборудование
Получение конечного продукта метаболизма в производственном ферментаторе составляет основную и часто самую длительную стадию во всем технологическом цикле выращивания. Одно из основных требований, которое предъявляется к ферментатору, - сохранение стерильности при интенсивной аэрации питательной среды во время всего периода культивирования. Ферментатор (рис. 2.14) представляет собой герметичную цилиндрическую емкость со сферическими крышкой и днищем. Объем аппарата может быть от 0,01 до 100 м3. Высота ферментаторов в 2-2,5 раза превышает диаметр. Лучший материал для изготовления ферментатора - нержавеющая сталь.
Ферментатор снабжен термостатирующим, перемешивающим, аэрирующим и регулирующим pH среды устройствами, оборудован системой подачи питательной среды, пеногасителя, воды, пара и т. д. Тепло, выделяемое в период роста микроорганизмов, отводится с помощью различных теплообменных конструкций. Это прежде всего внутренние, спиральные, трубчатые змеевики (рис. 2.15).
С помощью змеевиков стерилизуют также ферментаторы, пропуская пар вместо охлаждающей воды. Для термостатирования процесса культивирования технологически наиболее выгодно использование теплоизоляционных материалов. Введение внутрь ферментатора дополнительных змеевиков затрудняет его стерилизацию и мойку.
Производственное культивирование проводят в стерильных условиях. Перед заполнением ферментатора питательной средой его моют, проверяют на герметичность, стерилизуют. Одновременно с ферментатором паром стерилизуют также всю систему трубопроводов. В ферментатор, заполненный стерильной питательной средой (объем обычно не превышает 70 % общего объема аппарата), вводят посевной материал. Предварительно температуру и pH питательной среды доводят до оптимальных значений для данного микроорганизма-продуцента.
Стадия производственного культивирования для большинства микроорганизмов длится 48-72 ч. Однако имеются бактериальные культуры, длительность выращивания которых не превышает 24 ч; продолжительность культивирования некоторых актиномицетов и микроскопических грибов длится 12 сут. На протяжении всего этого периода растущую глубинную культуру необходимо снабжать кислородом. Микроорганизмы могут использовать только растворенный кислород. Насыщение кислородом питательной среды осуществляется путем аэрации, обеспечивающей контакт между воздушной и жидкой фазами. Наибольшее распространение в микробиологической промышленности получили аэрирующие устройства барботажного типа (рис. 2.16).
Для успешного выращивания производственных культур большое значение имеет предотвращение пенообразования. Все ферментаторы снабжены устройствами для введения пеногасителя и контроля высоты пены в аппарате. Для снижения пенообразования используют химические (растительные и животные масла, различные силиконы) и механические (циклоны, вращающиеся в верхней части ферментатора лопасти) средства пеногашения. Применение противопенных агентов следует расценивать как неотъемлемую часть аэробного выращивания микроорганизмов. Характер вводимых пеногасителей и периодичность их подачи в ферментатор должны строго контролироваться. Излишнее добавление пеногасителя или излишнее внесение его на заключительной стадии культивирования может осложнить процесс выделения конечного продукта и свести к минимуму то дополнительное количество продукта, которое было получено во время производственного культивирования.
Характеристика некоторых натуральных пеногасителей приведена в табл. 2.3.
В процессе культивирования ведется постоянный контроль за состоянием культуры и накоплением продуктов биосинтеза, фиксируется потребление основных компонентов среды (углеводы, азот, фосфор), контролируется pH культуральной жидкости.
Методы культивирования
В микробиологической промышленности для выращивания микроорганизмов применяют поверхностный и глубинный методы. В общем виде их можно представить как ряд стадий, приводящих к получению из посевного материала (малое количество биомассы микроорганизмов) значительного количества биомассы или биомассы и продуктов метаболизма.
Поверхностный метод выращивания применим только для аэробных культур, причем их можно вырастить на твердой сыпучей питательной среде или на поверхности тонкого слоя жидкой среды. Во всех случаях, где первоначально поверхностный метод давал большие выходы продуктов при подборе определенных условий, в конечном счете глубинный метод оказывался более выгодным в промышленности.
Глубинный метод выращивания микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным (проточным).
При периодическом процессе изменяются скорость роста, физиолого-биохимические и морфологические показатели культуры. Развитие культуры при периодическом способе выращивания начинается с лаг-фазы, длительность которой зависит от условий выращивания посевного материала. Обычно происходит перепад концентраций элементов питания - снижение в выросшей культуре, т. е. в готовом посевном материале, и повышение в засеваемой среде. Клетки посевного материала должны перейти из состояния голодания или отравления (например, продуктами метаболизма) в состояние, соответствующее способности к размножению.
Затем следует экспоненциальная фаза, характеризующая способность культуры к размножению. В этой фазе сведено до минимума влияние лимитирующих и ингибирующих факторов. Компоненты питательной среды имеются в избытке, продукты обмена еще не накопились. Рост культуры идет с максимально возможной скоростью, генетически заложенной в клетке. Эта фаза не может быть длительной, так как со временем популяция начинает испытывать недостаток в одном или нескольких элементах питания либо ингибирующее рост влияние накапливающихся в среде продуктов обмена.
Фаза замедления роста может быть очень разнообразной и самой сложной. Она может полностью отсутствовать на простых синтетических средах, когда рост сразу прекращается из-за отсутствия одного элемента питания, в особенности источника углерода и энергии. На сложных средах, содержащих несколько источников углерода, может происходить поочередное их потребление и постепенное замедление роста культуры. При избытке источников питания рост культуры замедляется из-за накопления продуктов метаболизма.
Токсичные продукты метаболизма у микроорганизмов очень разнообразны.
После прекращения по той или иной причине роста клеток наступает стационарная фаза. В этой фазе в популяции могут присутствовать разные клетки: живые, но голодающие, живые, но ингибированные, отмирающие по причине голодания или отравления.
Таким образом, микробные клетки при периодическом культивировании претерпевают значительные изменения в течение всего периода роста, обусловленные непрерывными изменениями окружающей среды и быстрой реакцией на них клеток.
Совсем другие условия развития культуры наблюдаются при непрерывном (проточном) культивировании, варианты которого различаются по способу поддержания культуры в динамическом равновесии.
Различают открытые и замкнутые системы непрерывного культивирования.
В открытых системах клетки постоянно вымываются вытекающей жидкостью со скоростью образования в системе новых клеток; в этих условиях легко достигается их устойчивая концентрация.
В замкнутых системах клетки в какой-то мере задерживаются в системе и их количество все возрастает. В этих условиях одни лимитирующие факторы сменяют другие, наконец, большая часть клеток отмирает, и такая система не в состоянии достигнуть установившегося динамического равновесия. Замкнутые системы значительно менее пригодны, чем открытые для осуществления точного регулирования всех условий культивирования, управления ими и автоматизации процесса.
Непрерывный процесс может быть гомогенно- и гетерогенно-непрерывным. При гомогенно-непрерывном процессе в ферментаторе с интенсивным перемешиванием все параметры (концентрация питательных веществ, скорость роста микроорганизмов) постоянны во времени. При гетерогенно-непрерывном процессе несколько ферментаторов соединяют в батарею. При этом не обеспечиваются постоянные условия роста клеток, так как в каждом ферментаторе поддерживаются постоянные условия культивирования, но отличные от условий в другом ферментаторе.
Метод проточного культивирования может быть организован как процесс полного вытеснения и как процесс полного смешения.
При процессе полного вытеснения сосуд для выращивания микроорганизмов представляет собой трубку (тубулярный ферментатор), в который подается питательная среда и посевной материал и из которого вытекает культура (рис. 2.17). Перемешивания культуры не производится. Этот процесс применим для культивирования анаэробных микроорганизмов. Когда среда и посевной материал поступают в ферментатор, клетки находятся в начале своего развития. По ходу трубки происходит развитие культуры, выражающееся в использовании субстрата, накоплении продуктов метаболизма, и перед вытеканием культура находится в состоянии, аналогичном стационарной фазе роста периодической культуры. Можно сказать, что в трубке воспроизводится полная кривая роста, но не во времени, а в пространстве. Подобная картина наблюдается в батарее проточных ферментаторов.
В процессе полного смешения рост культуры происходит в емкости-ферментаторе при интенсивном перемешивании, достигаемом продуванием воздуха и работой мешалки. Во всей массе культуры, условия выращивания должны быть одинаковыми (гомогенно-непрерывный процесс).
При гомогенно-непрерывном процессе в ферментаторе могут быть созданы условия, соответствующие любой точке кривой роста культуры выращиваемой периодическим способом. При быстром протоке среды эти условия близки к условиям экспоненциального роста, при медленном - приближаются к условиям стационарной фазы. В установившемся режиме удельная скорость протока среды равна удельной скорости роста культуры. При этом культура находится в состоянии динамического равновесия и обладает способностью автоматически подстраиваться к изменениям условий. Если условия изменяются так, что рост ускоряется, то в ферментаторе повысится плотность популяции и установится новое стационарное состояние. Если рост замедлится, плотность популяции понизится. Если изменение условий будет временным, то при возвращении к исходным условиям установится первоначальное стационарное состояние.
При таком способе культивирования нельзя получить устойчивого состояния только при максимальной скорости роста. Незначительное повышение скорости протока или воздействие, замедляющее рост, приводят к тому, что скорость роста окажется меньше скорости протока и культура быстро вымоется из ферментатора.
Хорошо отработанный периодический процесс выращивания экономически выгодно воспроизводить проточным методом культивирования, так как культура непрерывно находится в состоянии максимальной активности и не тратится время на подготовку ферментатора, его заполнение, слив и на лаг-фазу.
При гомогенно-непрерывном культивировании можно осуществить недоступное при периодическом культивировании ограничение роста культуры одним элементом питания при нелимитируемых количествах остальных элементов. При медленном протоке ограничение роста будет сильным, при быстром - слабым. Такое непрерывное культивирование называется хемостатным (или хемостат), так как рост микроорганизмов регулируют химические факторы среды. При хемостатном культивировании соблюдаются два условия: 1) гомогенно-непрерывное культивирование ведется с определенной заданной скоростью протока среды; 2) компоненты среды подбираются таким образом, чтобы один элемент питания был в недостатке, тогда плотность популяции определяется его концентрацией. Все остальные элементы питания даются в избытке, а условия культивирования (температура, pH, аэрация) поддерживаются на оптимальном уровне.
Хемостатный метод имеет большое число вариантов. Применение одностадийного культивирования позволяет воспроизвести любую скорость роста, кроме максимальной. Двухстадийное культивирование в двух последовательно соединенных ферментаторах позволяет достичь максимальной скорости роста и даже превзойти ее. Для этого в первом ферментаторе батареи ведется нормальное культивирование при скорости протока, меньшей максимально возможной скорости роста в одном аппарате, а во второй - подается культура из первого и свежая среда (рис. 2.18, а). Во втором ферментаторе повышается скорость протока вплоть до превышения максимально возможной скорости роста, а вымывания не происходит, так как из первого ферментатора непрерывно поступает культура.
Максимальная скорость роста может быть достигнута при турбидостатном культивировании (в режиме турбидостата), при котором контроль за процессом осуществляется с помощью измерения концентрации микроорганизмов. Для этого ферментатор должен иметь устройство для нефелометрического измерения мутности, характеризующей концентрацию популяции в ферментаторе. Чтобы плотность (популяции) оставалась постоянной, регулируют скорость протока среды. Этот метод культивирования применим для выращивания микроорганизмов на прозрачных средах.
В двухстадийном культивировании можно повысить синтез вторичных метаболитов (антибиотиков, ферментов и т. д.) по сравнению с одностадийным хемостатным. В первом ферментаторе ведется выращивание культуры при большой скорости роста, что соответствует логарифмической фазе периодической культуры. Второй ферментатор используется большего объема (рис. 2.18, б), поэтому культура, поступающая из первого аппарата, оказывается в условиях замедленного роста в такой степени, в какой второй ферментатор содержит больше среды, чем первый. Это соответствует условиям стационарной фазы.
При низких концентрациях субстрата и невысокой плотности популяции можно возвратить в ферментатор часть клеток вместе с вытекающей из него культуральной жидкостью, чтобы повысить концентрацию клеток и ускорить процесс. Существует несколько вариантов возврата, например, сепарируют вытекающую культуру и сгущенную часть культуральной жидкости подают в ферментатор (рис.2.18,в).После ферментатора можно установить фильтрующее устройство, позволяющее вытекать культуральной жидкости, но задерживающее клетки (рис. 2.18, г).
Известны методы культивирования, занимающие промежуточное положение между непрерывным и периодическим:
1) отъемно-доливной - среда порциями подается в аппарат и также порциями отбирается из него;
2) добавление питания к периодической культуре без отбора культуры. Этот метод удлиняет время культивирования, но приводит к более полному использованию всех имеющихся в среде элементов питания, если постепенно добавлять, например, источник углерода.