Лимонная кислота
Лимонная кислота СН2СООН-СОНСООН-СН2СООН является трехосновной оксикислотой, кристаллизующейся из водных растворов с одной молекулой воды в виде бесцветных, прозрачных ромбической формы кристаллов.
Моногидратная форма лимонной кислоты имеет молекулярную массу 210, плотность 1,54 и температуру плавления 70-75 °С. При хранении и особенно быстро при нагревании до 40-50°С теряется кристаллизационная вода, при температуре 100 °С кристаллизационная вода теряется полностью.
При температуре кристаллизации 36,6 °С и выше выделяется безводная (температура плавления 153°С) лимонная кислота с молекулярной массой 192. При нагревании до 175°С кислота разлагается.
Лимонная кислота широко распространена в плодах и ягодах. Она находит применение в ряде отраслей пищевой промышленности (производство кондитерских изделий и напитков), химической и текстильной промышленности (окраска тканей, приготовление светочувствительных фотоэмульсий), медицине и т. д.
Мировое производство лимонной кислоты в настоящее время составляет около 130 тыс. т в год. При культивировании на углеводах в качестве продуцентов лимонной кислоты используют мутантные штаммы Asp. niger, на н-парафинах - дрожжи Candida lipolitica, Candida guilliermondii, Candida oleophila и бактериальные штаммы из рода Corynebacterium, Arthrobacter.
В Советском Союзе лимонную кислоту получают из мелассы микробиологическим синтезом, применяя главным образом микроскопические грибы Asp. niger, выращиваемые поверхностным или глубинным способом. Производство лимонной кислоты включает следующие основные технологические стадии: получение посевного материала, подготовку мелассы к сбраживанию, сбраживание растворов мелассы в лимонную кислоту с последующим отделением мицелия, выделение из сброженных растворов лимонной кислоты и получение ее в кристаллическом виде.
Химизм образования лимонной кислоты
Синтез лимонной кислоты связан с циклом дикарбоновых кислот и происходит в результате конденсации какой-либо кислоты, содержащей четыре атома углерода и две карбоксильные группы, с кислотой, имеющей два атома углерода и одну карбоксильную группу. Химизм образования лимонной кислоты представлен на рис. 4.1. В результате гликолиза глюкозы образуется пировиноградная кислота. На следующем этапе происходит ферментативное связывание пировиноградной кислоты с диоксидом углерода. Образовавшаяся щавелевоуксусная кислота вступает далее в реакцию с уксусной кислотой и образуется лимонная кислота. Таким образом, химизм образования лимонной кислоты включает реакции гликолиза и ряд реакций, замкнутых в цикл Кребса. При каждом обороте этого цикла молекула щавелевоуксусной кислоты вступает во взаимодействие с молекулой уксусной кислоты, образуя лимонную кислоту.
Получение посевного материала
Для производства лимонной кислоты поверхностным и глубинным способами используют отселекционированные штаммы Asp. niger. Исходные культуры хранят в виде сухих спор (конидий) в смеси с активным углем. Тщательно проверенная на микробиологическую чистоту и биохимическую активность музейная культура используется для приготовления посевного материала. Посевной материал размножают в пробирках с агаризованной средой (сусло-агар, среда Журавского и др.), а затем в колбах и кюветах - на твердой питательной среде. Длительность каждой стадии 2-7 сут, оптимальная температура выращивания 32 °С. В процессе выращивания на поверхности твердой среды развивается плотная мицелиальная пленка, которая затем покрывается конидиями. На последней стадии (из кювет) зрелые конидии собирают при помощи специального вакуумного устройства. Для удлинения срока хранения конидии подсушивают при 32 °С, смешивая со стерильным наполнителем - активным углем или тальком в соотношении 1:2. Обработанные таким способом конидии можно хранить 1-2 года. С 10 дм2 площади кювет получают 3-4 г сухих конидий (площадь одной кюветы 8,5 дм2). Готовый посевной материал фасуют в стерильные стеклянные колбы или банки вместимостью от 0,5 до 1 л. Посевной материал хранится при комнатной температуре и относительной влажности воздуха 70%. Гарантированный срок годности конидий не менее 6 мес. со дня выпуска.
Подготовка мелассы к сбраживанию
Многие органические вещества, главным образом сахара, сбраживаются с образованием лимонной кислоты. Хороший выход получают обычно, если используют в качестве источника углерода глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу. Для промышленного производства лимонной кислоты в качестве субстрата применяют обычно мелассу - отход сахарного производства.
Меласса - нестандартное сырье, ее химический состав зависит от качества сахарной свеклы, технологии переработки и условий хранения. Пригодность мелассы для производства лимонной кислоты определяют на основе предварительных биохимических испытаний. Растворы мелассы сбраживают поверхностной и глубинной культурой соответствующего штамма гриба Asp. niger. Меласса считается пригодной для производства лимонной кислоты поверхностным способом, если съем лимонной кислоты при контрольном сбраживании составляет не менее 1,25 кг/(м2-сут), глубинным способом - 10-12 кг/(м3-сут).
Хорошо сбраживаемые мелассы обычно содержат не более 1,0% инвертного сахара, 1% СаО, 0,06% SO2 при общем содержании сухих веществ не менее 75% и сахара более 46%. В зависимости от способа сбраживания мелассу разбавляют и готовят растворы с различной концентрацией сахара: для поверхностного выращивания Asp. niger до 13-15%, для глубинного культивирования - 3-4% и 25-28%. В приготовленных растворах серной кислотой доводят pH до 6,8-7,5. Необработанная меласса плохо ассимилируется и сбраживается микроорганизмом-продуцентом, так как наряду с веществами, необходимыми для нормального роста гриба и активного кислотообразования, в ней содержатся минеральные и ограничение примеси, тормозящие рост гриба и подавляющие процесс образования лимонной кислоты. Это ионы тяжелых металлов, в первую очередь железа.
Меласса, как было сказано выше, не единственный источник сырья для получения лимонной кислоты. За последние годы в различных странах мира запатентованы способы получения лимонной кислоты путем культивирования микроорганизмов, в основном дрожжей рода Candida, на средах, содержащих в качестве источника углерода н-парафины, глицерин, этанол, кислоты уксусную, масляную, животные или растительные жиры.
Сбраживание растворов мелассы
Поверхностный способ. При поверхностном способе сбраживания подготовленная меласса подается в варочный котел, где разбавляется кипящей водой в соотношении 1:1, pH раствора доводится до значения 6,8-7,2. При кипячении вводится раствор желтой кровяной соли для осаждения железа и солей тяжелых металлов с таким расчетом, чтобы избыток свободного ферроцианида, поскольку он угнетает развитие микроорганизма, не превышал 10 мг %. В раствор мелассы при температуре 60-70°С последовательно добавляют источники фосфора (обычно стерильный раствор фосфата калия) и другие минеральные вещества, например сульфат цинка, стимулирующий биосинтез лимонной кислоты и рост мицелия. Для активного биосинтеза лимонной кислоты в питательной среде кроме сахара должны содержаться 0,07% азота, 0,016-0,021% Р2O5, цинк, магний, калий и другие элементы в небольших количествах. Готовая среда температурой 45-50 °С передается в бродильные камеры. Культивирование гриба осуществляется в кюветах из нержавеющей стали толщиной 2 мм или из алюминия марки АО-МО толщиной 4-5 мм, установленных на стеллажах. После предварительной стерилизации камер парами формалина, дегазации газообразным аммиаком и охлаждения до 30-40 °С воздухом производится (начиная с верхних) заполнение кювет питательной средой. В зависимости от высоты борта кювет питательный раствор наливают слоем от 8 до 18 см. В камере предусмотрена система вентиляции для подачи нагретого (до 30-32°С) стерильного кондиционированного воздуха из расчета 3-18 м3/ч на 1 м2 поверхности кювет. В питательную среду через воздуховоды с помощью специального устройства для распыления вносят посевной материал из расчета 50-75 мг конидий на 1 м2 площади кювет.
При поверхностном способе различаются 3 режима культивирования: бессменный, бессменный с доливами и односменный.
При бессменном режиме гриб Asp. niger культивируется на одной и той же питательной среде до окончания процесса кислотообразования. При односменном режиме культивирования примерно через 7 сут сброженный раствор мелассы сливается и после промывки пленки стерильной водой заливается новый раствор. Наиболее эффективным режимом культивирования является так называемый бессменный способ с доливом. Суть его заключается в том, что раствор мелассы в количестве 30-35% начального объема вводится под пленку гриба. Долив питательной среды производится один или несколько раз, начиная с 4-5-х суток роста, через каждые 36-48 ч. Добавляемый раствор мелассы содержит 8,5-11,0% сахара и не имеет в своем составе питательных солей и антисептиков. Такой режим обеспечивает увеличение съема лимонной кислоты с 1 м2 бродильной поверхности на 15-20 % и снижает удельный расход мелассы на 10-15 % по сравнению с другими методами.
В первые 24-36 ч, когда происходит интенсивный рост мицелия гриба, температуру поддерживают в пределах 34-36 °С. Для аэрации на каждый квадратный метр растущего мицелия подают 3-4 м3/ч воздуха. В период активного кислотообразования температуру раствора снижают до 32-34 °С, а подачу воздуха увеличивают до 15-18 м3/(м2-ч). По мере снижения интенсивности кислотообразования и уменьшения количества выделяемого тепла подачу воздуха в камеру постепенно снижают. Ежедневно, начиная с 5-х суток, отбирают пробы для определения титруемой кислотности и остаточного сахара. Брожение прекращают, когда в растворе остается 1-2% сахара и общая титруемая кислотность в сброженном растворе достигает 12-20%. Сброженный раствор сливают в сборник. Для промывки мицелия под грибную пленку подливают горячую воду. После слива промывных вод мицелий по вакуум-линии транспортируют в запарник, где мицелий отмывают от кислоты горячей водой. Кислые растворы (концентрация 2,5-6,0%), собранные из-под ложного днища запарника, подают на фильтр-пресс. Выгруженный из запарника с помощью шнека мицелий используется на корм скоту.
При поверхностном способе брожения основные растворы содержат от 12 до 20% органических кислот в пересчете на лимонную кислоту, 0,5-2,0% несброженных сахаров и другие продукты метаболизма. Лимонная кислота в сброженных растворах составляет 94-98%.
Глубинный способ. При глубинном способе сбраживания мелассных растворов процесс ведут в ферментаторах вместимостью 50 м3, разовая загрузка - 38 м3 (рис. 4.2). Конидии проращивают в посевных аппаратах вместимостью 5 м3 с рабочим объемом 3 м3. Все аппараты должны быть выполнены из нержавеющей стали Х18Н9Т.
Раствор мелассы, содержащий 3-4% сахара, для посевных аппаратов готовят в варочном котле. Мелассу разбавляют кипящей водой, устанавливают pH 7,0-7,2. Для удаления железа при кипячении добавляют желтую кровяную соль. Растворы хлорида аммония и сульфата магния вводят в регламентированных количествах. Подготовленный раствор стерилизуют при 128-130 °С в течение 12-15 мин. В раствор мелассы, охлажденный в посевном аппарате до 35-36 °С, добавляют стерильные растворы К2НРО4 и MgSO4-7H2O. Для производственного ферментатора раствор мелассы готовят в той же последовательности. Растворы питательных солей готовят отдельно и стерилизуют при температуре 123-125 °С. Воду стерилизуют при 128-130 °С.
Подливной раствор должен иметь 25-28%-ную концентрацию по сахару и температуру 34-36 °С, как и основной сбраживаемый раствор. Подливной раствор направляют в сборник. Посевной аппарат засевают предварительно подготовленной суспензией конидий (3 г сухих конидий замачивают в 2-3 л стерильного раствора мелассы или питательной среды). Культуру выращивают при 34-35°С при постоянном перемешивании, дробной аэрации и избыточном давлении в аппарате 10-20 кПа.
В период интенсивного вспенивания среды (12-24 ч) небольшими порциями подают пеногаситель (олеиновая кислота). Процесс подращивания мицелия заканчивается к 30-36 ч. Общая титруемая кислотность культуральной жидкости составляет 1,0-2,0%. Подращенный мицелий передают для засева среды производственного ферментатора.
Процесс кислотообразования продолжается 5-7 сут при температуре 31-32 °С, непрерывном перемешивании и дробной аэрации.
Начиная со 2-х суток после посева по мере снижения концентрации сахара в растворе проводят 2-3 подкормки. Дробное введение подливного 25-28%-ного раствора обычно проводят из расчета доведения конечной концентрации сахара в сбраживаемом растворе до 12-15%. Контроль за нарастанием титруемой кислотности и расходом сахара позволяет вовремя определить конец процесса и получить наибольший съем лимонной кислоты с 1 м3 ферментатора в сутки (не ниже 7,5 кг/м3). После окончания процесса сброженный раствор нагревают острым паром до 60-65 °С и сливают в сборник, откуда его подают на вакуум-фильтр для отделения и промывки мицелия горячей водой. Отделенный и промытый мицелий направляется на корм скоту. Основной раствор лимонной кислоты вместе с промывными водами передается в химический цех.
При глубинном способе сбраживания основные растворы содержат от 5 до 12 % органических кислот, 0,2-1,5% сахара, а лимонная кислота составляет 80-98% °т суммы всех кислот. Схема выделения лимонной кислоты из сброженных растворов представлена на рис. 4.3.
Получение цитрата кальция
Сброженные растворы представляют собой смесь лимонной, глюконовой и щавелевой кислот, несброженного сахара и минеральных примесей. Лимонную кислоту из раствора выделяют путем связывания ее катионами кальция с образованием слаборастворимой соли цитрата кальция.
Нейтрализацию осуществляют в нейтрализаторах, снабженных мешалками и паровыми барботерами. Сброженный раствор нагревают в нейтрализаторе до кипения, после чего в него при непрерывном перемешивании вводят известковое или меловое молоко. Полноту нейтрализации определяют с помощью индикатора. Она считается законченной при pH 6,8-7,5. При нейтрализации сброженного раствора образуются кальциевые соли лимонной, глюконовой и щавелевой кислот.
Кальциевые соли лимонной и щавелевой кислот выпадают при этом в осадок, а кальциевая соль глюконовой кислоты и основная часть органических и минеральных веществ мелассы остаются в растворе. Для отделения образовавшегося осадка горячую реакционную массу передают на вакуум-фильтры. После отделения маточного раствора осадок на фильтре промывают горячей водой (температура около 95 °С). Об окончании промывки судят по отсутствию в промывных водах сахара. Для подсушивания через осадок в течение некоторого времени пропускают воздух.
Перевод лимонной кислоты в свободное состояние и отделение ее от оксалата кальция достигается обработкой осадка серной кислотой с последующим фильтрованием. Разложение цитрата кальция осуществляют в реакторе, снабженном мешалкой и паровым барботером. В реактор подают воду из расчета 0,25-0,5 м3 на 1 т лимонной кислоты и при работающей мешалке загружают туда цитрат кальция с таким расчетом, чтобы после его разложения концентрация лимонной кислоты в растворе была не меньше 25%. В качестве осветлителя в реактор вводят активный уголь (2% к массе лимонной кислоты), содержимое реактора нагревают до 60 °С и при перемешивании подают из мерника серную кислоту (плотность 1,80-1,84) из расчета 0,425 л на 1 кг лимонной кислоты в цитрате. Смесь кипятят в течение 10-20 мин.
Разложение цитрата кальция серной кислотой протекает по уравнению
После полного разложения цитрата кальция (контролируют по отсутствию в среде цитрата кальция и серной кислоты) в реактор вводят гранулированный сернистый барий (из расчета 0,10-0,15 кг на 100 кг лимонной кислоты) для осаждения тяжелых металлов. Для отделения раствора лимонной кислоты от осадка, содержащего гипс, оксалат кальция, уголь, сернистые соединения тяжелых металлов и берлинскую лазурь, горячую реакционную смесь направляют из реактора на вакуум-фильтр. Отфильтрованный раствор передают на дополнительное упаривание, а осадок на фильтре промывают горячей водой (90°С). Промывку осадка прекращают при содержании лимонной кислоты в промывной воде 0,1 %. Средняя концентрация раствора лимонной кислоты (вместе с промывными водами) должна быть не ниже 16%.
Упаривание раствора лимонной кислоты
Упаривание осуществляют в вакуум-аппаратах и проводят в две стадии с промежуточным освобождением раствора от осадка гипса. В первом аппарате раствор упаривают до плотности 1,24-1,26 (под остаточным давлением 0,021 МПа), осадок отделяют на фильтр-прессе. Во втором аппарате прозрачный раствор упаривают (под остаточным давлением 0,021 МПа) до плотности 1,35-1,36, что соответствует концентрации лимонной кислоты 80% (около 1070 г моногидрата в 1 л).
Кристаллизация и сушка лимонной кислоты
Из вакуум-аппарата вторично упаренный раствор температурой 70 °С передают на кристаллизацию.
После заполнения кристаллизатора раствор охлаждают до 35-37 °С и вносят в него затравку - кристаллы лимонной кислоты. Кристаллизацию проводят при непрерывном перемешивании и медленном охлаждении до температуры 8-10 °С. При конечной температуре кристаллизации раствор выдерживают не менее 30-45 мин. Кристаллы отделяют в центрифуге, промывают их небольшим количеством холодной воды, затем кристаллы влажностью 2-3% передают на сушку.
Сушку проводят в ленточных или барабанных пневматических сушилках при температуре воздуха не более 35 °С. При: более высокой температуре происходит разрушение кристаллов вследствие потери ими кристаллизационной воды. В товарном продукте должно содержаться не менее 99,5% лимонной кислоты (в пересчете на моногидрат), зольность не более 0.1% для высшего сорта и 0,35% для I сорта.