Бактериальные удобрения

В повышении плодородия почвы большая роль принадлежит различным почвенным микроорганизмам, которые в процессе своего роста и развития улучшают структуру почвы, накапливают питательные вещества для растений, способствуют повышению коэффициента использования минеральных и органических удобрений, и тем самым повышению урожая. Деятельность почвенных микроорганизмов стимулирует применение различных бактериальных удобрений, которые обогащают почву и особенно ризосферу растений полезной микрофлорой. В почве связанный азот представлен в основном четырьмя видами соединений: азотом аммонийных солей азотом нитратов (NO3-), органическим азотом белков и продуктов их расщепления - аминокислот, пептидов, аминов и амидов, а также азотом гумуса.

Аммонийный и нитратный азот лучше усваиваются растениями, чем его органические соединения, за исключением мочевины, аспарагина и глутамина, т. е. соединений, от которых легко отщепляется аммонийный азот. Поэтому в природных условиях большое значение для питания растений азотом имеют почвенные микроорганизмы, которые минерализуют содержащийся в почве органический азот, превращая его в конечном счете в аммиак, являющийся тем исходным соединением, которое используют растения для синтеза аминокислот и белков.

С. Н. Виноградский в 1893 г. впервые выделил почвенную анаэробную спороносную бактерию, способную фиксировать молекулярный азот, и назвал ее в честь великого естествоиспытателя Л. Пастера - Clostridium pasteurianum. Позднее, в 1901 г., Бейеринк открыл вторую свободноживущую азот-фиксирующую бактерию Azotobacter. Аэробный характер обмена Azotobacter обусловливает более высокую продуктивность азотофиксации, чем у Cl. pasteurianum, поэтому практическое применение нашли представители рода Azotobacter.

Практическое применение нашли также симбиотические бактерии рода Rhizobium, поселяющиеся в клубеньках корней некоторых растений. Способность бобовых растений усваивать азот атмосферы обусловлена именно жизнедеятельностью этих симбиотических азотофиксаторов.

В практике сельского хозяйства широкое распространение получили следующие бактериальные удобрения: нитрагин, азотобактерин, фосфоробактерин.

Нитрагин

Представляет собой препарат клубеньковых бактерий рода Rhizobium, которые в симбиозе с бобовыми растениями фиксируют азот атмосферы, обеспечивая тем самым азотное питание растений. Чистая культура клубеньковых бактерий была выделена Бейеринком в 1888 г. Клубеньковые бактерии - аэробные, мелкие иногда подвижные, бесспоровые, грамотрицательные палочки, размером (0,5-0,9)х1,2х3,0 мкм. При старении они теряют подвижность и приобретают вздутые, грушевидные или ветвистые изогнутые формы, называемые бактероидами. Существует связь между наличием бактероидов в клубеньках растений и интенсивностью фиксации азота. По скорости роста на питательных средах клубеньковые бактерии делят на быстрорастущие и медленнорастущие.

Различают активные, малоактивные и неактивные культуры клубеньковых бактерий. Под активностью клубеньковых бактерий понимают способность их в симбиозе с бобовым растением усваивать атмосферный азот и снабжать этим азотом растение. Необходимо подчеркнуть, что активность клубеньковых бактерий непосредственно связана со специфичностью. По ряду признаков клубеньки, образованные активными культурами Rhizobium, отличаются от клубеньков, сформированных неэффективными штаммами. В частности, активные формы окрашены в розовый тон благодаря наличию в них пигмента леггемоглобина, близкого по составу к гемоглобину крови животных. Неэффективные клубеньки имеют зеленоватую окраску.

Процесс азотофиксации протекает только в клубеньках на корневой системе бобовых растений, образуемых под влиянием проникающих в корень бактерий. Как правило, проникновение клубеньковых бактерий в корни бобовых происходит через корневые волоски. Взаимоотношения бобовых растений с клубеньковыми бактериями зависят от условий роста растений и их физиологического состояния, а также определяются основными свойствами бактерий - вирулентностью и активностью. Под вирулентностью понимают способность бактерий проникать через корневые волоски внутрь корня бобового растения и вызывать образование клубеньков. Большое значение имеет скорость этого проникновения. Клубеньковые бактерии обладают избирательной способностью в отношении инфицирования растений, которая положена в основу классификации этих бактерий внутри рода Rhizobium. Эта классификация бактерий представлена ниже.

Согласно современным представлениям процесс азотофиксации - это восстановительный процесс превращения газообразного азота в аммиак и дальнейшая его ассимиляция. Микроорганизмы, фиксирующие азот, синтезируют специальный фермент нитрогеназу, в активном центре которого и происходит активирование чрезвычайно инертной молекулы N=N и восстановление ее в NH3.

У большинства азотофиксаторов главную роль в ассимиляции образовавшегося аммиака играют ферменты (глютаминсинтетаза, глютаматсинтаза, глютаматдегидрогеназа). Результатом их действия является образование из аммиака глутамина и глутаминовой кислоты, которые в дальнейшем используются клеткой для биосинтеза белка.

Для роста и развития клубеньковые бактерии требуют наличия в питательной среде различных источников углерода (сахароза, декстрины, мальтоза, левулеза и др.), органических и минеральных форм азота, в том числе аминокислот (пролин, аланин, цистин, цистеин, глицин, аспарагиновая). Клубеньковые бактерии хорошо растут на средах, содержащих отвар семян бобовых растений, а также кукурузный и пшеничный экстракты. Большое значение в питании клубеньковых бактерий имеют калий, кальций, фосфор, магний и некоторые микроэлементы (железо, марганец, молибден и др.).

Оптимальные температуры для развития клубеньковых бактерий 26-28 °С, pH в интервале 6,5-7,5.

Микробиологическая промышленность Советского Союза выпускает нитрагин двух видов: почвенный и сухой. Почвенный нитрагин-культура клубеньковых бактерий, размноженная в стерильной почве. В 1 г препарата содержится не менее 300 млн. клубеньковых бактерий. Технология производства почвенного нитрагина недостаточно совершенна, а поэтому не всегда обеспечивается высокое качество препарата. Такие процессы, как приготовление и дозировка среды, инокуляция субстрата, не механизированы. Много осложнений вызывают заготовка плодородной почвы, ее стерилизация, транспортировка препарата. При длительных перевозках резко снижается количество клубеньковых бактерий, необходимых для эффективной инокуляции. Почвенный препарат также неудобен в применении. При влажной нитрагинизации увлажняется, перелопачивается и подсушивается большое количество семенного материала.

Сухой нитрагин представляет собой порошок клубеньковых бактерий с наполнителем (бентонит, торф). Влажность препарата 5-7%. В 1 г его содержится в среднем не менее 9 млрд. жизнеспособных клубеньковых бактерий. По эффективности действия сухой нитрагин не уступает почвенному, а в ряде случаев превосходит его. После обработки семян гороха сухим нитрагином в 3-4 раза увеличивались число клубеньков на корнях и одновременно количество азота в растениях, а также повышалось содержание белка в зерне, что способствовало получению полноценного урожая.

Следует отметить, что если одна гектарная порция (500 г почвы, засеянной клубеньковыми бактериями) почвенного нитрагина вместе с бутылкой весит 1 кг, то одна гектарная порция сухого нитрагина в 2,5 раза меньше по массе. Сухим нитрагином семена опыляют, причем этот процесс можно механизировать. При получении сухого препарата в промышленном масштабе применяют лиофильный способ высушивания клубеньковых бактерий, что позволяет длительное время сохранять жизнеспособность клеток.

Для получения в промышленных условиях сухого нитрагина высокого качества (основной показатель - число жизнеспособных клеток в 1 г препарата) проводится предварительная оценка штаммов на их продуктивность и устойчивость к высушиванию. Для каждой культуры бобовых растений нитрагин готовят из проверенных соответствующих культур группы клубеньковых бактерий, которые микробиологи получают в результате тщательного отбора, исходя из способности фиксировать азот и интенсивности проникновения в корневую систему растений. Например, семена фасоли обрабатывают нитрагином для этой культуры, семена гороха - нитрагином для гороха. Ниже приведена технология производства сухого нитрагина.

Для получения посевного материала исходную культуру клубеньковых бактерий, выращенную на агаризованных средах (отвар семян бобовых, 1% сахарозы, 2% агара), культивируют в жидкой питательной среде в течение 24-48 ч при температуре 28-30 °С и pH 6,5-7,5. На всех этапах производства сухого нитрагина жидкие питательные среды содержат вещества минеральные – NaHCO3, (NH4)2SO4, MgSO4, К2НРО4, NaCl и др. - и органические - мелассу, кукурузный экстракт. Выросшей культурой, содержащей до 8-10 млрд. клеток в 1 мл, засевают 100-250-литровые посевные инокуляторы. Культивирование при температуре 30 °С продолжается 18-24 ч, титр клеток возрастает до 2 млрд./мл. Из инокулятора готовая посевная культура клубеньковых бактерий передается для засева производственных ферментаторов. Культивирование продолжается при температуре 28-30 °С в течение 48-72 ч при pH 6,5-7,2, а также интенсивном перемешивании и аэрации (1:0,8). После стадии ферментации титр клеток возрастает до 10 млрд./мл. Биомассу от культуральной жидкости отделяют на сепараторах (частота вращения 4500-10000 об/мин). Получаемую пасту 70-80%-ной влажности смешивают с защитной средой, содержащей 20% мелассы и 1% тиомочевины. Обезвоживание или сублимация клубеньковых бактерий (до 2-5% остаточной влажности) проводится под вакуумом (остаточное давление 10-13 кПа) при 30-35 °С. Высушенную биомассу размалывают на шаровых мельницах и смешивают с наполнителем (каолин, торф, бентонит) до получения препаратов, содержащих в среднем не менее 9-10 млрд. клубеньковых бактерий. Препарат сухого нитрагина фасуют и герметизируют в полиэтиленовых мешках, хранят при температуре не выше 15 С.

Азотобактерин

Представляет собой препарат аэробной бесспоровой культуры свободноживущего почвенного микроорганизма Azotobacter chroococcum, способного фиксировать (до 20 мг/г использованного сахара) атмосферный азот.

Молодые клетки Azotobacter имеют вид коротких палочек с закругленными концами размером (2,0-7,0)x1,0x2,5 мкм. При старении клетки становятся округлыми, покрываются слизью, которая уплотняется и превращается в защитную капсулу.

Для роста и развития культуры в качестве источника углерода применяются спирты, в частности маннит, кислоты, лактоза и др. При наличии в питательной среде нескольких источников углерода они используются азотобактером в порядке доступности. Среди источников азота микроорганизм ассимилирует соли аммония, азотистой и азотной кислот, мочевину и не усваивает монокарбоновые аминокислоты (лизин, аргинин, гистидин, аланин, глицин), производные пурина и пиримидина. Азотобактер особенно чувствителен к содержанию в среде фосфора, источником которого могут быть органические и неорганические фосфорсодержащие соединения. Отсутствие его резко замедляет развитие бактерий и снижает азотофиксацию. Стимулирующее действие на азотофиксирующую активность микроорганизма оказывают соединения молибдена, поэтому его соли всегда добавляют в питательную среду.

Технология производства сухого азотобактерина аналогична таковой сухого нитрагина. Готовый препарат фасуют в полиэтиленовые мешки, которые герметизируют в связи с гигроскопичностью препарата. Сухой азотобактерин хранят при температуре не выше 15 °С.

В практике встречаются и другие виды азотобактерина, например почвенный и торфяной. Для их приготовления используют богатую перегноем почву или разлагающийся торф с нейтральной реакцией среды. К просеянной почве или торфу добавляют 1-2% извести и 0,1% суперфосфата. Затем по 500 г этой смеси переносят в бутылки на 0,5 л, увлажняют водой до 40-60% (по объему), закрывают ватными пробками и стерилизуют. На агаровых средах, содержащих 1-2% сахарозы и минеральные соли, выращивают посевной материал. Культуру выращивают при температуре 26-27 °С около 72-120 ч до тех пор, пока поверхность агара не покроется слизистой массой. Массу клеток стерильно смывают водой и переносят в стерильную почву или торф. Содержимое тщательно перемешивают, а затем термостатируют при 25-27 °С. В каждом грамме почвы или торфа должно быть не менее 50 млн. клеток. Длительность хранения препарата 2-3 мес. На обработку семян для засева 1 га пашни требуется 3-6 кг почвенного азотобактерина.

С начала 30-х годов азотобактерин применяли как аналог азотных удобрений. Позднее выяснилась способность Azotobacter продуцировать биологически активные вещества, и его действие на растение стали связывать не только с процессом азотофиксации и улучшения азотного питания растений, но и с поступлением в растения вырабатываемых им биологически активных соединений. Азот, фиксируемый Azotobacter, существенно повлиять на величину урожая не может. Вместе с тем он несомненно в определенных условиях улучшает рост растений. Последнее объясняется еще и тем, что данный микроорганизм синтезирует комплекс биологически активных веществ: никотиновую и пантотеновую кислоты, пиридоксин, биотин, гетероауксин, гиббереллин и, возможно, другие соединения. Комплекс этих соединений способен стимулировать прорастание семян растений и ускорять их рост. Установлено, что Azotobacter способен выделять фунгицидные вещества, относящиеся к группе анисомицина. Поэтому при бактеризации в ризосфере угнетается развитие микроскопических грибов, многие из которых задерживают рост растений. Эти бактерии весьма требовательны к условиям среды и активно развиваются лишь в плодородных почвах. Эффект азотобактерина определяется численностью клеток даже в плодородной почве.

Фосфоробактерин

Препарат содержит споры культуры Bacillus megaterium var. phosphaticum, которые превращают сложные фосфорорганические соединения (нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды и др.) и трудноусвояемые минеральные фосфаты в доступную для растений форму. По морфологическим и культуральным признакам Bac. megaterium представляет собой мелкие, аэробные, спорообразующие палочки размером (5-6)x(1,8-2) мкм. Бактерии размножаются на питательных средах с глюкозой, сахарозой, мальтозой, которые служат источником углерода. В качестве источника азота используют аспарагин, пептон, сульфат аммония. На средах с нитратами растут хуже, восстанавливая нитратный азот до нитритов и аммиака. В присутствии серосодержащих аминокислот бактерии выделяют сероводород.

Фосфоробактерин - бактериальное удобрение, широко применяемое в сельском хозяйстве Советского Союза. Считается, что фосфоробактерин более эффективен при использовании на черноземных почвах, где запас фосфороорганических соединений особенно велик.

Фосфоробактерин нельзя сопоставить по эффективности с минеральными фосфорными удобрениями. Он не может заменить фосфорные удобрения и не действует без них. Эффективность фосфоробактерина на почвах, удобренных суперфосфатом, повышается, что до известной степени зависит от дозы нанесенного на семена фосфоробактерина. Это, видимо, связано с биологически активными веществами вырабатываемыми Bac. megaterium, - тиамином, пиридоксином, биотином, пантотеновой и никотиновой кислотами, витамином В12 и др.

Биологически активные вещества при бактеризации попадают на семя растения, а затем и в его ткани, они благоприятно действуют на первых этапах роста и развития растений. Это способствует улучшению не только фосфорного, но и азотного питания растений, т. е. усиливается усвоение всех питательных элементов.

В целом можно считать, что фосфоробактерин является препаратом стимулирующего действия. Технология производства фосфоробактерина существенно не отличается от таковой, применяемой для получения сухого нитрагина и азотобактерина.

Лиофилизированная культура Bac. megaterium размножается в глубинных условиях на среде следующего состава (в %): кукурузный экстракт 1,8, меласса 1,5, сульфат аммония 0,1, мел 1,0. Выращивание проводят в ферментаторах при температуре 28-30 °С в течение 30-48 ч при pH 6,5-7,5 на той же среде в аэробных условиях до стадии образования спор. Многие штаммы Bac. megaterium чувствительны к действию бактериофагов поэтому на стадии ферментации может возникнуть фаголизис. В одних случаях лизируется вся бактериальная масса, в других снижается число бактериальных клеток. Причина фаголизиса - инфицирование культуры извне или образование специфических форм бактериофагов на различных этапах производства. В комплексе мероприятий по борьбе с фаголизисом особое внимание уделяется стерильности процесса на всех этапах производства бактериальных препаратов, а также селекции и отбору устойчивых к фагам производственных культур. От культуральной жидкости выросшую биомассу отделяют центрифугированием. Затем ее высушивают при 65-75 °С в сушилках распылительного типа. Остаточная влажность препарата 2-3%. При высушивании он относительно стабилен в отличие от сухого нитрагина и азотобактерина. Сухой фосфоробактерин хранят при комнатной температуре, в течение года жизнеспособность теряют не более 20% клеток. В 1 г препарата должно быть не менее 8 млрд. жизнеспособных клеток.