Слияние протопластов

Исследования с культурой клеток и тканей намного расширили и углубили знания о процессах, протекающих в клетке, о функциях ее составных частей, о той роли, которую играют клетки при образовании тканей и целых растений. В то же время эти исследования показали, что изолированная клетка, входящая в состав целого организма, не в состоянии реализовать все свои функции, которые присущи ей в той или иной степени. Одна из причин этого заключается в том, что клеточная оболочка, или мембрана, является существенным препятствием на пути передвижения веществ как внутрь клетки, так и обратно, особенно если клетка изолирована. Постепенно при проведении исследований клеточную мембрану стали устранять и получать так называемые протопласты, т.е. растительные клетки без оболочек. Вначале мембраны устраняли механически, а позже - химическим способом с помощью ферментов целлюлазы, пектиназы и др.

Чаще всего протопласты изолируют из листьев, затем из конусов нарастания, корней, корневых клубеньков бобовых и микроспор. Приблизительно у 50 видов довольно успешно проведено изолирование протопластов, из которых регенерированы целые растения. Наиболее результативно процесс удалось осуществить у представителей родов Brassica, Nicotiana, Petunia и Solanum.

Вскоре было замечено, что культура протопласта обладает значительно большими возможностями. Два протопласта можно объединить, чего нельзя добиться у клеток, имеющих мембраны. Это быстро привело к мысли о слиянии клеток двух различных видов, которые половым путем скрещиваться не могут. Таким образом, удалось получить синтетические видовые гибриды, поэтому метод слияния протопластов клеток называют парасексуальной гибридизацией.

Суть метода вкратце заключается в следующем: из измельченных листьев или других органов растений получают суспензию клеток, затем с помощью ферментов устраняют мембраны. У каждого вида нужно изолировать миллионы протопластов. Суспензию протопластов одного вида смешивают с суспензией протопластов другого вида. Полученную смесь помещают в пробирку и центрифугируют, чтобы перемешать протопласты, которые в большинстве своем сливаются друг с другом. Затем, соблюдая стерильные условия, при определенной температуре, освещенности и т.д. суспензию протопластов наносят на питательные среды в чашки Петри. Через некоторое время очень небольшое число клеток начинает образовывать каллус и развиваться в растение. Из этих регенерантов отбирают те растения, которые образовались от слияния протопластов разных видов; для подтверждения этого проводят цитологический анализ хромосом в соматических клетках растений.

Первое объединение протопластов клеток различных видов Petunia провели Пауэр с соавт. в Англии и видов Nicotiana - Карлсон с соавт. в США (табл. 20.1). Пример соматического гибрида Nicotiana glauca X N. langsdorfii свидетельствует о получении растений, резко различающихся по форме листа, высоте стеблей и другим признакам (рис. 20.2). Наряду с различными отклоняющимися по числу хромосом формами удалось получить растение, в семенах которого было 2n = 42 хромосом, т.е. полный набор из 24 хромосом от вида N. glauca и 18 хромосом от вида N. langsdorfii. Практически в данном случае ничего не достигнуто, и все же продемонстрирована возможность соматической гибридизации двух видов, которые половым путем вообще не могут скрещиваться.

С давних пор человек пытается получить гибрид томатов и картофеля, растения которого имели бы плоды томатов на стебле и клубни картофеля в почве. Такое растение, если можно так выразиться, обладало бы двойным потенциалом продуктивности. Половая гибридизация оказалась безуспешной, так как эти виды между собой полностью несовместимы. Лишь развитие методов слияния протопластов позволило осуществить гибридизацию томатов с картофелем. Мельхерсу с сотр. в ФРГ удалось получить два растения, содержащих хромосомы и цитоплазму томатов и картофеля. Данный метод еще несовершенен, и эти растения, ослабленные и низкорослые, не содержащие всех хромосом от обоих видов, имеют много недостатков. Это всего лишь сырой материал, однако можно надеяться, что по мере усовершенствования техники слияния клеточных протопластов, а также выращивания полученных гибридных растений с одновременным проведением отборов по определенным признакам грандиозный замысел осуществится, т.е. будет синтезирован новый вид. Метод слияния протопластов, естественно, позволит получать новые синтетические виды, которые другими методами вывести нельзя, однако не следует ожидать, что он во всех случаях будет иметь практическую ценность. Отдельные виды и роды настолько отличаются друг от друга, что слияние клеток может привести к ингибированию эффекта отдельных генов, вызвать новые ответные реакции и нарушение процессов обмена веществ, нежелательных для селекции. Следовательно, на вновь возникшие гибриды должен действовать естественный отбор, выравнивающий определенным образом процессы метаболизма.

Культура протопластов располагает и такими экстраординарными возможностями, как, например, перенос клеточных органелл или микроорганизмов в клетки высших растений. Так, Карлсон (1973) описывает удачное выделение хлоропластов из зеленого вида табака и передачу их мутанту-альбиносу, что позволило получить от таких протопластов зеленое растение табака. Этот пример еще недостаточно убедителен, потому что можно регенерировать зеленое растение и от протопласта-альбиноса.

Перенос митохондрий, выделенных из цмс-растений кукурузы, Petunia и других, в протопласты нормальных видов позволяет определить гены, контролирующие цмс и сам механизм функционирования этого типа стерильности. Исследования по переносу клеток бактерий, дрожжей и водорослей в протопласты оказались безуспешными с точки зрения активности этих клеток в чужеродной среде. Трудно ожидать генетической автономности хлоропласта, митохондрий и других органелл внутри клетки данного вида, не говоря уже о клетках других видов. Поэтому любой успешно осуществленный перенос клеточных органелл или микроорганизмов в протопласты клеток дает ценную информацию для генетических и физиологических исследований, а по мере дальнейшего усовершенствования технологии в будущем можно ожидать получения живых организмов с новыми свойствами, что принесет пользу и в селекции растений.