Культура тканей

Уже в начале XX века Хаберландт указал на тотипотентность соматических клеток растений и возможность получать растения с помощью культуры тканей. Однако потребовалось более полувека, прежде чем удалось овладеть методами выращивания in vitro суспензии клеток, гормональной регуляции роста и формирования органов, а также регенерации целого растения. Первые успехи были достигнуты с культурой ткани моркови (рис. 20.1) и гибридов табака.

Благодаря проведенным исследованиям соответствующих методов экстрагирования растительных клеток и тканей удалось вызывать ускоренное деление клеток и получать гомогенную ткань каллуса. Такую ткань далее выращивают на питательной среде, которая, помимо других компонентов, содержит гормоны роста - ауксины, стимулирующие рост корней, и цитокинины, вызывающие рост конуса нарастания; в результате получают целое растение. (Перечень видов, из культуры тканей которых удалось регенерировать целые растения, приведен в работе Вэсила и др.) Работа с однолетними растениями, плодовыми культурами и злаковыми травами оказалась более успешной, чем с многолетниками, бобовыми культурами и лесными породами. Культура меристематических тканей стала уже стандартным методом клонового размножения орхидеи и других садовых растений. Огромное преимущество этого метода заключается и в том, что с его помощью получают материал, не зараженный вирусами, бактериями или грибами, в значительной степени осложнявшими процессы размножения в прежние времена.

Особое значение имеет клоновое размножение с использованием метода культуры тканей для лесных пород, характеризующихся продолжительным развитием поколений. Получать растения древесных видов с помощью культуры тканей растения достаточно трудно, но это удалось в опытах с тополем и сосной.

Культуру зародыша применяют уже довольно давно как метод получения межвидовых и межродовых гибридов, у которых удается осуществить скрещивание, но семена погибают из-за недоразвитости эндосперма.

Культура пыльника и пыльцы. У большинства видов регенерацию целого растения легче осуществить из гаплоидных тканей, чем из диплоидных. Кроме того, в клетках гаплоидных тканей содержится только один набор хромосом и при определенных обстоятельствах могут появиться рецессивные мутации; поэтому в данном случае намного легче вызвать спонтанные или индуцировать новые мутации.

Поскольку частота появления гаплоидных растений в природе весьма низка (см. главу 18), их получают путем культуры пыльников и пыльцы. У значительного числа видов покрытосеменных удалось с помощью культуры пыльника вырастить каллус или эмбриоид, особенно в семействах Solanaceae и Gramineae, однако лишь у небольшого числа видов из каллуса удалось регенерировать целое растение - табак, капуста, томаты, райграс, рис, пшеница, тополь, петуния и др. (перечень примеров с указанием литературы см. в работе Вэсила и др.).

Лишь 0,5-5% пыльцевых зерен проходит андрогенез в максимальных условиях культуры, однако если учесть, что только в одной чашке Петри находится огромное число пыльцевых зерен, успех в получении каллуса может быть удовлетворительным. Андрогенез чаще всего протекает в ходе митотического деления вегетативных клеток микроспор, что и приводит к развитию гаплоидных растений. Поскольку пыльцевое зерно содержит еще и два генеративных ядра, а некоторые виды к тому же представляют собой природные полиплоиды, среди регенерантов наряду с гаплоидами появляются и растения с разными уровнями полиплоидии, развивающиеся в результате слияния ядер или эндомитоза. Это, естественно, создает трудности, так как истинных гаплоидов получить не удается.

Следует подчеркнуть большие успехи с культурой пыльников пшеницы, риса и других растений, достигнутые в Китае. Во-первых, разработана очень благоприятная питательная среда для развития пыльцевых зерен, что позволяет получать каллусы и выращивать целые растения. Во-вторых, определена оптимальная фаза развития для культуры пыльников - середина унинуклеарной стадии с температурой 28-30°С. Особое значение имеет и получение наряду с гаплоидами значительного числа спонтанных диплоидов. Это позволило прийти к выводу, что растения F1, полученные из пыльников, весьма пригодны для работы и с их помощью можно быстро создавать гомозиготные линии.

По личному сообщению д-ра Тсун Вена (1981), методика культуры пыльников пшеницы вкратце сводится к следующему. На питательную среду высевают приблизительно 100 000 пыльников растений пшеницы F1, получая около 5000 (5%) зеленых растений, развивающихся из 5000 различных групп каллусных клеток.

Из этих растений регенерируют:
- около 3000 (60%) растений-гаплоидов (Зx);
- около 500 (10%) растений-гетероплоидов, включая и нуллисомики;
- около 1500 (30%) растений-диплоидов (6x).

Из 1500 диплоидных растений около 150 (10%) гетерозиготно по меньшему числу генных каллусных клеток, а ~1350 (90%) полностью гомозиготно.

Диплоидные растения возникают при спонтанном удвоении хромосом. Поскольку они появляются с относительно высокой частотой к общему числу растений из пыльцы, их используют для создания чистых линий; при этом отпадает потребность в обработке гаплоидных растений (Зх) колхицином с целью удвоения числа хромосом.

Пыльца растения F1 в действительности представляет поколение F2, таким образом за один год удается получить большое число гомозиготных линий, которых в противном случае необходимо ожидать в течение шести поколений. Следовательно, данный метод культуры пыльника может оказаться очень полезным при сокращении сроков ведения селекции; если бы удалось решить и технические проблемы, он смог бы найти массовое применение.

Получение гаплоидных растений преследует главную цель - создание гомозиготных диплоидных линий для использования гетерозиса; оно помогает решить и другие задачи, позволяя избегать длительного процесса инбридинга. Метод культуры пыльников дает возможность выводить гомозиготные линии и у автонесовместимых видов, что имеет огромное значение для многолетних растений, особенно для лесных пород. Существуют и иные возможности использования гаплоидов, о чем уже говорилось в главе 18.

Культивирование взятых в отдельности клеток (сахарный тростник и др.) позволило бы обнаружить спонтанные и индуцированные мутации, из которых наибольшее число, как правило, элиминирует в процессе отбора на диплоидном и гаплоидном уровне и которые никогда не удается выделить. Вероятно, этот метод будет способствовать более активному использованию мутаций непосредственно в селекции растений.