Спектральные (оптические) методы анализа. Спектральные измерения в видимой и УФ-областях спектра
Световое излучение может поглощаться молекулой вещества. При этом возрастание энергии молекулы равно энергии поглощенного кванта света (фотона). Внутренняя энергия молекул не может изменяться непрерывно. Каждая молекула обладает набором определенных квантованных энергетических состояний, которые отличаются друг от друга энергией электронов, энергией колебания ядер и энергией вращения молекулы. Излучение в УФ и видимой областях спектра дает кванты света, достаточные, чтобы вызвать электронные переходы с одного уровня на другой. Так как энергия излучения падает с увеличением длины волны, то видимый свет может вызвать переход электрона лишь на близко расположенный уровень, а УФ-излучение может вызвать большие электронные переходы.
Степень ослабления интенсивности света, прошедшего через вещество (раствор вещества), характеризуют либо пропусканием Т, выраженным в процентах:
либо поглощением:
Точная квантово-механическая трактовка спектров поглощения возможна только для простых молекул. В основном применение спектроскопии для изучения строения молекул носит эмпирический характер. Поглощение в ближней УФ- и видимой областях спектра обычно связано с наличием в молекуле ненасыщенных связей и атомов с неподеленными парами электронов. Группы атомов, которые приводят к поглощению в ближней УФ-области (200-400 нм) и видимой (400-750 нм) области спектра, называются хромофорами. Полосы поглощения многих хромофоров перекрываются, что создает низкую специфичность поглощения. Пики поглощения в УФ- и особенно в видимой областях очень широкие и спектры искажаются примесями.
Наиболее сильное изменение в спектре по сравнению со спектром, содержащим отдельные хромофоры, происходит в случае их сопряжения. Если хромофоры разделены несколькими метиленовыми группами и сопряжение исчезает, то спектр таких молекул является аддитивной суммой спектров молекул, содержащих отдельные хромофоры.
Ультрафиолетовую область спектра подразделяют на далекую (вакуумную) ультрафиолетовую (10-200 нм) и близкую кварцевую (200-400 нм). Вакуумная УФ-область в техническом анализе химико-фармацевтических препаратов в настоящее время не используется, поэтому мы будем рассматривать приборы и методы исследования в ближней УФ-области. В качестве источников освещения для УФ-области в отечественных спектрофотометрах используют лампы с дуговым разрядом, наполненные дейтерием или водородом. Водородные или дейтериевые лампы излучают энергию в виде непрерывного спектра в области 185-375 нм. Для работы в видимой области используют лампы накаливания, излучение которых лежит в области 320-1100 нм. В заводских и научно-исследовательских лабораториях наиболее распространены спектрофотометры СФ-4А, СФ-16. Это однолучевые показывающие приборы, работающие в области УФ- и видимой части спектра.
Спектрофотометр СФ-4А предназначен для измерения пропускания или оптической плотности различных жидких и твердых прозрачных веществ в области спектра от 220 до 1100 нм. Прибор используется как в научно-исследовательских, так и в промышленных лабораториях.
Спектрофотометр СФ-4А представляет собой моно-хроматор, соединенный с приемно-усилительным и потенциометрическим устройством. Монохроматор служит для выделения из сплошного спектра источника излучения монохроматической (т. е. все волны в которой имеют одинаковую частоту) полосы. Для разложения спектра служит кварцевая призма, а нужную монохроматическую полосу с выбранной длиной волны выделяют с помощью узкой щели. Отношение световых потоков, прошедших через эталон и образец при поочередном помещении их в один и тот же монохроматический пучок света, определяется с помощью компенсационной схемы. Отсчет снимается со шкалы отсчетного потенциометра.
Рис. 20. Схема устройства спектрофотометра СФ-16.
1 - фотометрическая часть; 2 - кюветное отделение; 3 - камера с приемником и усилителем.
Приемником лучистой энергии служат сурьмяно-цезиевый и кислородно-цезиевый фотоэлементы.
Пределы измерения оптической плотности составляют от 0 до 2, пропускания - 0-100%.
Более совершенным прибором с тем же принципом устройства, но лучшими техническими характеристиками является спектрофотометр СФ-16 (рис. 20), предназначенный для измерения пропускания или оптической плотности в области спектра от 186 до 1100 нм.
На спектрофотометре измеряют пропускание или оптическую плотность образца относительно пропускания или оптической плотности эталона. Пропускание эталона принимается за 100%, а оптическая плотность - равной нулю. Эталон и образец поочередно устанавливают на пути света определенной длины волны, выходящего из монохроматора. Отношение светового потока, прошедшего через образец, к световому потоку, прошедшему через эталон, определяется по шкале отсчетного потенциометра.
Излучение лампы с помощью системы зеркал фокусируется на входную щель монохроматора. Далее пучок света попадает на диспергирующую поворотную призму, изготовленную из высококачественного оптического кварца, которая разлагает излучение в спектр. Излучение с нужной длиной волны "вырезается" из сплошного спектра выходной щелью. Вращая призму монохроматора, можно получать на выходе из него свет различных длин волн, который, пройдя через образец или эталон, попадает на светочувствительный слой фотоэлемента.
Спектрофотометр СФ-16 (см. рис. 20) состоит из монохроматора с фотометрической частью 1, кюветного отделения 2, камеры с приемником и усилителем 3 и осветителя с источниками излучения 4. Монохроматор и фотометрическая часть смонтированы на основании 5, к которому жестко крепится вспомогательное основание 6, несущее на себе съемные части прибора: кюветное отделение и камеру с приемниками и усилителем. На основании 5 крепятся все основные элементы монохроматора (зеркала, призма, щели и т. д.). Для устранения влияния температуры окружающего воздуха на постоянство градуировки монохроматор закрывается дополнительным кожухом. Для компенсации кривизны спектральных линий ножи входной и выходной щелей искривлены. Рабочая высота каждой" щели 13 мм; раскрытие и закрытие щелей одновременно с точностью до 0,001 мм в пределах от 0 до 2 мм.
В области 186-200 нм поглощение световой энергии кислородом воздуха влияет на точность измерений. Поэтому конструкцией предусмотрена возможность продувки монохроматора сухим азотом.
В приборе имеется два источника непрерывного спектра: дейтериевая лампа для работы в области 186-350 нм и лампа накаливания для работы в области 320-1100 нм. Смена источников излучения производится в области 320-350 нм простым переключением с помощью рукоятки зеркального конденсора. Для градуировки прибора по длинам волн в области 202-1100 нм используется ртутная лампа, которую устанавливают вместо дейтериевой.
За выходной щелью монохроматора установлен диск с фильтрами, поглощающими рассеянный свет.
Испытуемые образцы и эталоны устанавливают в кюветной камере, где имеются держатели для твердых образцов и кювет. Для исследования жидкостей в комплекте прибора есть кварцевые кюветы двух типов: прямоугольные и цилиндрические. Каретка с образцами перемещается с помощью рукоятки и имеет четыре фиксированных положения. Измерения проводят при плотно закрытой крышке кюветного отделения.
Фотоэлементы и усилитель расположены в специальной камере; в этой же камере размещен потенциометр темнового тока и осушитель - силикагель.
Порядок работы на приборе, его обслуживание, уход за ним, устранение мелких неисправностей и т. п. подробно описаны в инструкции, которой комплектуется каждый прибор. Точное выполнение всех требований инструкции является необходимым условием правильной работы прибора.
В настоящее время нашей промышленностью выпускаются также двухлучевые записывающие спектрофотометры СФ-8, СФ-9, СФ-17 и СФ-26. В заводских лабораториях они используются значительно реже, так как применение их оправданно при большом числе однотипных анализов.
Если в однолучевых приборах на пути монохроматического пучка света попеременно вручную устанавливаются эталон и испытуемый образец, то в двухлучевых приборах эталон и образец закреплены неподвижно, а монохроматизированный пучок света разделяется специальным зеркалом на два одинаковых по интенсивности луча: луч сравнения и луч образца. Вращающимся экраном перекрывают попеременно то луч сравнения, то луч образца, чем достигается разделение их во времени. Далее каждый из лучей проходит соответственно через эталон и образец и поступает на фотоэлемент или фотоумножитель. Полученный электрический сигнал усиливается и подается на специальное электронное устройство, где он разделяется на два канала: сигнал от кюветы сравнения и сигнал от кюветы образца. В обоих каналах сигналы усиливаются, детектируются и подаются на самописец, который регистрирует отношение сигнала образца к сигналу эталона, т. е. степень пропускания световых лучей через кювету с исследуемым образцом по сравнению с пропусканием через кювету с эталоном (например, чистым растворителем).
В качестве примера можно привести основные технические данные распространенного регистрирующего спектрофотометра СФ-8.
Спектрофотометр СФ-8 предназначен для качественного и количественного анализа в диапазоне спектра 210-2500 нм, т. е. охватывает ближнюю УФ-, видимую и ближнюю ИК-области спектра.
Монохроматор прибора двойной. Предварительная монохроматизация осуществляется призменным моно-хроматором. В основном монохроматоре имеются две диффракционные решетки, работающие в первом и втором порядках. Широкий диапазон работы прибора обеспечивается сменными решетками, сменными источниками и приемниками излучения.
Постоянный уровень сигнала поддерживается автоматической регулировкой ширины щели.
Результаты измерения регистрируются на специальном бланке. Скорость перемещения бумаги может меняться в пределах 2-16 мм/мин, а скорость развертки спектра - от 0,5 до 250 нм/мин (рис. 21).
В техническом анализе спектральные определения в УФ- и видимой области используют либо для идентификации анализируемого вещества (установление его идентичности эталонному образцу), либо для определения его концентрации. В первом случае записывают спектр поглощения вещества в указанной области в виде графика в координатах e -лямбда. или lg е - лямбда и сравнивают его со спектром эталона. Во втором случае пользуются либо калибровочным графиком, либо законом Бугера - Ламберта - Бера (предварительно проверив подчинимость ему исследуемых растворов), рассчитывая концентрацию по уравнению:
Молярный десятичный коэффициент поглощения е лямбда (коэффициент экстинкции), равный оптической плотности раствора исследуемого вещества с концентрацией 1 моль/л при толщине слоя 1 см, берут по данным литературы или определяют экспериментально по эталонному образцу. Величина е лямбда зависит от длины волны проходящего света, температуры раствора и природы вещества. Большая часть спектрофотометрических работ проводится с растворами.
Рис. 21. Современный УФ-спектрофотометр.
Чтобы уменьшить ошибку измерений, следует подбирать концентрацию растворов таким образом, чтобы величина поглощения анализируемого раствора была 0 2-0,7 (что соответствует оптической плотности 0,4-1,4).
Растворители для приготовления растворов следует выбирать с большой осторожностью, так как природа растворителя влияет на вид спектра поглощения. Растворитель не должен взаимодействовать с анализируемым веществом. Растворители должны быть химически устойчивыми и хорошо очищенными ("спектроскопически чистыми"). Полосы поглощения анализируемого вещества должны лежать в области более длинных волн, чем полосы поглощения растворителя. Ароматические растворители непригодны для УФ-области ниже 300 нм, четыреххлористый углерод поглощает при 250 нм, дихлорэтан - при 230 нм и т. д. Наиболее прозрачными растворителями для УФ-области до 200 нм являются вода, насыщенные углеводороды, этиловый и метиловый спирты. В справочниках приведены таблицы, в которых отмечены рекомендуемые нижние пределы волн для различных растворителей. При повышенных температурах на внутренних поверхностях кювет появляются пузырьки воздуха, которые искажают измеряемое оптическое поглощение. Необходимо также учитывать испарение растворителя, которое приводит к повышению концентрации раствора. Испарение можно уменьшить, используя кюветы с пришлифованными тефлоновыми пробками.
Хотя спектры в УФ- и видимой областях не являются характеристическими, они могут служить для идентификации вещества, особенно при наличии эталонного спектра. Корреляция полос УФ-поглощения с определенными структурными компонентами молекулы осуществляется главным образом с помощью аналогий. Величина коэффициента молярного поглощения также является важным фактором, так как иногда на основании измерений интенсивности можно различить хромофорные группировки, положение полос поглощения которых совпадает. Надо, однако, иметь в виду, что введение в молекулу нового заместителя может сдвинуть положение максимума поглощения и изменить значение 8х. Спектральная кривая может изменить вид также при изменении растворителя, значения рН или температуры. Поэтому спектральные кривые следует относить к строго определенным условиям. Присутствие даже небольшого количества примеси вещества, обладающего высоким значением е лямбда, может привести к значительной ошибке в определении.
Спектр поглощения вещества в видимой области обычно представляет собой одну или несколько широких (размытых) полос. Поэтому в простейших случаях использование спектрофотометра с монохроматическим излучением не является обязательным. Возникает возможность пользоваться для аналитических целей значительно более простым прибором - фотоэлектроколориметром.
Фотоколориметрическое определение основано на том, что световой поток проходит через кювету с окрашенным анализируемым раствором. Прошедший через раствор световой поток воспринимается фотоэлементом. Сила электрического тока, возникающего при действии световой энергии на фотоэлемент, прямо пропорциональна интенсивности освещения.
Поскольку растворы одного и того же окрашенного вещества при одинаковой концентрации его и толщине слоя раствора поглощают равное количество световой энергии, то, сравнивая показания чувствительного гальванометра в фотоэлектроколориметре (ФЭК) при измерении поглощения стандартного и испытуемого растворов, можно по калибровочной кривой или по закону Бугера - Ламберта - Бера определить концентрацию в анализируемом образце. В фотоэлектроколориметре нет дорогостоящего монохроматора, а для устранения влияния возможных окрашенных в другой цвет примесей нужную часть спектра выделяют, помещая между лампой накаливания и кюветой с образцом стеклянный цветной светофильтр.
Наша промышленность выпускает несколько моделей фотоэлектроколориметров, из которых наиболее распространенными являются ФЭК-М, ФЭК-56, ФЭК-Н-52 (54, 57) и др. Это показывающие двухлучевые приборы с двумя фотоэлементами. Конструкция приборов предусматривает уравнивание интенсивности двух световых потоков с помощью щелевой диафрагмы. Световой пучок от лампы накаливания делится на два с помощью двух зеркал. Отразившись от зеркал, световые пучки проходят светофильтры, кюветы со стандартным и испытуемым растворами и попадают на фотоэлементы. Они соединены с гальванометром таким образом, чтобы при равенстве интенсивностей световых пучков, падающих на фотоэлементы, стрелка гальванометра была на нуле (равные, но противоположные токи). Методика работы изложена в инструкции к прибору.
Для определения концентрации вещества при помощи калибровочной кривой готовят серию стандартных окрашенных растворов, концентрации которых охватывают область возможных изменений концентрации исследуемого раствора. Затем измеряют величины их оптических плотностей и строят график зависимости оптической плотности раствора от концентрации растворенного вещества в координатах D = f(C). Построенную кривую называют градуировочной, или калибровочной (калибровочный график). Для построения калибровочной кривой обычно используют 5-8 точек со значениями концентрации, отличающимися не менее чем на 30% (при соблюдении основного закона светопоглощения). Концентрации стандартных растворов выбирают такими, чтобы величина оптической плотности исследуемого раствора находилась примерно в середине калибровочной кривой. Построенную калибровочную кривую периодически проверяют (раз в неделю, иногда реже) по 2-3 свежеприготовленным стандартным растворам. Определив оптическую плотность исследуемого раствора Dx, находят ее значение на оси ординат, а затем на оси абсцисс - соответствующее значение Сх. Содержание вещества gx (мг) в исследуемом растворе вычисляют по формуле:
где Vx - объем окрашенного исследуемого раствора, мл; V1 - объем аликвотной части исследуемого раствора, взятой для приготовления окрашенного раствора, мл; Vобщ - общий объем исследуемого раствора, мл.
При отсутствии фотоэлектроколориметров и спектрофотометров концентрацию окрашенных растворов можно определять визуальными методами, что менее точно и более трудоемко.
К визуальным относятся метод стандартных серий и метод уравнивания окрасок.
Метод стандартных серий заключается в следующем. В 10-12 мерных колориметрических пробирок из одинакового стекла наливают различные, постепенно возрастающие (на 20-30%) количества раствора определяемого вещества, прибавляют во все пробирки одинаковое количество реактивов и проделывают все операции, необходимые для переведения определяемого вещества в окрашенное соединение. Затем растворы во всех пробирках разбавляют дистиллированной водой до одинакового объема (до метки), перемешивают и закрывают притертыми пробками. Крайние пределы концентрации определяемого вещества в стандартной серии выбирают, исходя из возможных изменений ее в исследуемом растворе. Анализируемый окрашенный раствор готовят аналогично по той же прописи и переносят в такую же колориметрическую пробирку. После этого ее сравнивают с отдельными пробирками стандартной серии, выбирая такую, в которой раствор имеет наиболее близкую окраску к исследуемому раствору. Концентрация последнего принимается равной концентрации вещества в этой колориметрической пробирке стандартной серии. Если окраска исследуемого раствора является промежуточной между цветами двух соседних пробирок стандартной серии, то для него принимают среднее значение их концентраций.
Метод стандартных серий применяется при выполнении массовых однотипных анализов, главным образом в неприспособленных для аналитических определений условиях. Этот метод не требует специального оборудования. Основные недостатки его - малая точность (10% относительных) и частая смена окрашенных растворов стандартной серии.
Метод уравнивания окрасок основан на уравнивании окрасок анализируемого раствора с известной концентрацией определяемого вещества (эталонного раствора).
Окраски двух растворов с разной концентрацией окрашенного вещества уравнивают путем изменения толщины слоев этих растворов при одинаковой силе проходящего через растворы светового потока. В момент равенства окрасок отношение толщин слоев двух сравниваемых растворов обратно пропорционально отношению их концентраций. Измерив толщину слоев двух одинаково окрашенных растворов и зная концентрацию одного из этих растворов, по уравнению (см. далее) можно рассчитать концентрацию окрашенного вещества в другом растворе.
Для измерения толщины слоя, через который проходит световой поток, применяют специальные приборы - колориметры.
Принцип работы колориметров погружения основан на визуальном уравнивании светопоглощения окрашенными растворами путем изменения толщины поглощающего слоя. Изменение толщины слоев окрашенных растворов осуществляется при помощи погружателей (подвижные цилиндры, изготовленные из оптического стекла), связанных с отсчетной шкалой. Для получения более точных измерений колориметр снабжен набором светофильтров, выделяющих различные участки спектра.
Уравнивание интенсивности окрасок производят следующим образом: в два одинаковых цилиндрических сосуда (кюветы) наливают стандартный и исследуемый окрашенные растворы. При помощи одного погружателя устанавливают определенную толщину слоя стандартного раствора, а затем, вводя соответствующий светофильтр, при помощи второго погружателя изменяют толщину слоя исследуемого раствора до создания одинаковой освещенности (одинаковой окраски) обеих половинок поля в окуляре колориметра, т. е. до равенства светопоглощения исследуемого и стандартного растворов. По данным измерения рассчитывают концентрацию определяемого вещества в растворе по формуле:
где Сопр - концентрация определяемого вещества в испытуемом растворе; Сэт - концентрация того же вещества в эталонном растворе; Нопр - высота слоя испытуемого раствора; Hэт - высота слоя эталонного раствора.
Метод уравнивания является одним из наиболее точных визуальных методов, позволяет использовать светофильтры, но требует обязательного соблюдения подчинения растворов закону Бугера - Ламберта - Бера.