Методы контроля в производстве антибиотиков
Под названием «антибиотики» принято подразумевать вещества, продуцируемые микробами или другими более высокоразвитыми растительными и животными организмами, обладающие антибактериальной активностью.
Для оценки химиотерапевтических свойств того или иного антибиотика принята биологическая активность. Способность убивать микроорганизмы или тормозить рост и развитие называют биологической активностью препарата. Для количественного выражения биологической активности введено понятие единицы действия (ЕД). ЕД - это активность определенной массы антибиотика, принятого за стандарт. Единицы действия каждого антибиотика указаны в соответствующих фармакопейных статьях.
В качестве стандарта используют максимально чистые образцы антибиотического вещества с заранее вычисленными теоретическими величинами активностей, которые определяются химической структурой соединений - стандартов и весовым выражением их единиц действия (табл. 14).
Для определения биологической активности антибиотиков наряду с микробиологическим применяют химические и физико-химические методы.
Для равномерного и непрерывного процесса производства антибиотиков во всех стадиях необходимо подвергать процесс систематическому и целенаправленному аналитическому контролю. С этой целью в контрольно-аналитических заводских лабораториях проводят предварительный контроль сырья и вспомогательных веществ, межоперационный контроль как ферментации, так и химической очистки, контроль готового продукта.
Сырье для ферментации антибиотиков контролируется как биологически, так и химически. Большинство питательных субстратов, применяемых в производстве антибиотиков, является веществами растительного или микробного происхождения. Пригодность такого вида сырья определяют путем ферментации в малом объеме. При этом вычисляют выход антибиотика. Для сравнения применяют контрольные образцы, выбранные из тех партий сырья, которые уже неоднократно зарекомендовали себя. Из этих контрольных образцов сырья приготавливают питательную среду, причем каждый раз один из ее компонентов заменяют исследуемым образцом. Контролем служит среда, составленная из одних контрольных образцов. Ферментация проводится в стеклянных колбах на качалках. Среды с испытуемыми образцами сырья не должны давать существенного снижения уровня активности антибиотика по сравнению со средой, составленной только из контрольных образцов. Опыты повторяют 2-3 раза. В каждый опыт обычно берут 3 колбы с испытуемым сырьем и 3 колбы с контрольным сырьем.
Таблица 14. Единицы действия различных антибиотиков
Важным фактором для успешного проведения биосинтеза антибиотиков является тщательная проверка качества питательной среды. На каждой стадии выращивания и в ходе самой ферментации необходимо проверить, не произошло ли заражения питательной среды чужеродными микроорганизмами.
Другим важным фактором является соблюдение оптимальных условий ферментации. В ходе проведения ферментации осуществляют микроскопическое наблюдение за состоянием культуры микроорганизма - продуцента. Так, например, в производстве пенициллина биологическим путем исследуют морфологию мицелия, процесс увеличения вакуолей и степень аутолиза.
Для определения степени аутолиза окрашивают цитоплазму раствором кротонового синего в присутствии молочной кислоты и фенола. Отсутствие посторонних микроорганизмов в культуральной жидкости является одним из основных условий биосинтеза антибиотиков. При этом большое значение имеет своевременное определение отсутствия заражения в посевном материале, передаваемом из посевных аппаратов в ферментеры. Контроль стерильности осуществляется в высеве в пробирки на питательный бульон и агар. Для выявления посторонней микрофлоры при данном методе требуется 24-48 ч, а выращивание посевного материала в посевных аппаратах производят в течение 2-3 сут. Не исключены случаи, когда заражение может быть обнаружено уже после использования посевного материала для засева ферментера. Контроль стерильности проводят обычным путем при помощи встряхивания пробирок, так как темп роста микроорганизмов при глубинном выращивании в этих условиях повышается.
При производстве антибиотиков необходимо контролировать также стерильность производственного процесса. В ходе ферментации контролируется отсутствие чужеродных микробов. При этом испытания проводят путем высева образца на питательную среду, пригодную для роста грибов: бульон, кровяной агар.
Концентрацию антибиотика в культуральной жидкости в процессе ферментации наряду с биологическими методами определяют и химическими методами. Химический анализ ферментационной среды необходимо провести в самом начале ферментации, еще перед засевом. В ходе самого процесса ферментации измеряют состав питательной среды: содержание Сахаров, общего, аминного и аммонийного азота. По разности между содержанием общего и растворенного азота судят об уровне мицелиального азота. Эта величина совместно с непосредственным определением сухой массы мицелия используется для информации о ходе роста микроорганизма-продуцента, а также о начале его аутолиза.
В технологическом процессе производства антибиотиков в стадиях ферментации и выделения очень важны измерение, регистрация и регулировка рН.
Величина рН и другие химические показатели могут указывать на плохое начало ферментации задолго до того, как это проявится впоследствии в низком уровне накопления антибиотика. Своевременный контроль дает возможность исправить многие ошибки и тем самым сохранить партию ферментации.
При выделении антибиотиков из культуральной жидкости необходимо обращать особое внимание на возможность потерь антибиотика.
Для контроля общей массы, объема раствора и т.д. аппаратура должна быть снабжена указателями или расходомерами. При экстракции антибиотика из нативного раствора органическими растворителями необходимо прежде всего контролировать рН водной фазы, из которой производится экстракция. При работе с ионообменными колонками контролируют ход сорбции и десорбции. Важно установить при сорбции, когда колонка будет насыщена. Контроль ведется путем определения содержания антибиотика в вытекающей из колонки жидкости.
При осаждении антибиотика из колонки надо контролировать соблюдение оптимальных условий: рН, температуру и т.д. Даже небольшое отклонение от оптимальных значений может привести к значительным потерям антибиотика за счет инактивации или неполного осаждения. Наконец, полученный готовый антибиотик подвергают химической и биологической проверке по всем показателям, указанным в Государственной фармакопее или в другой нормативно-технической документации.