Колоночная хроматография

Колоночная хроматография, как адсорбционная, так и распределительная, является простым и удобным методом разделения смеси веществ.

Описанный выше метод адсорбционной колоночной хроматографии называется элюентным анализом. Как уже указывалось, при элюентном анализе подвижную жидкую фазу пропускают через колонку до тех пор, пока все зоны, образованные компонентами образца, не выйдут из колонки. Метод можно изменить, применяя последовательно несколько различных растворителей, подобранных таким образом, что каждый следующий является более эффективным элюирующим (вымывающим) агентом. Это позволяет ускорить процесс разделения смеси.

Для удовлетворительного разделения компонентов смеси важно соблюдать ряд условий при проведении анализа. Колонка не должна быть "перегружена" анализируемым веществом, т.е. размер пробы, загружаемой в колонку данного размера, ограничен. Рекомендуется использовать 25-50 г адсорбента на 1 г адсорбирующего материала при хорошей адсорбции и 100-1000 г адсорбента, если образец обладает слабой адсорбцией. Диффузия должна быть незначительной. Для этого используют плотный слой сорбента и увеличивают скорость движения подвижной фазы. Равновесие между подвижной и неподвижной фазами должно устанавливаться быстро. Это возможно лишь при большой скорости адсорбции и десорбции с неподвижной фазы.

Успех хроматографирования на колонке зависит главным образом от правильного выбора сорбента и подвижной фазы. Полярные сорбенты (например, окись алюминия) хорошо сорбируют полярные органические вещества из неполярных растворителей. Такие полярные вещества легко вытесняются из колонки полярным растворителем. Сорбенты классифицируют по их относительной полярности и емкости (т. е. способности сорбировать определенное количество вещества). Одним из наиболее распространенных сорбентов, используемых в колоночной хроматографии, является силикагель. По величине рН водной суспензии силикагель относят к слабокислым сорбентам. Обычно используют технический силикагель, содержащий 10-20% воды, хотя максимальная активность силикагеля достигается после нагревания в течение нескольких часов при 150-160 С. На силикагеле хорошо разделяются алкалоиды, сложные эфиры Сахаров, глюкозиды, липиды, глицериды, стероиды, аминокислоты. Использование метанола и этанола в качестве подвижной фазы снижает активность силикагеля.

Окись алюминия для хроматографии бывает основная, нейтральная и кислая. Кроме того, в зависимости от содержания воды (от 0 до 15%) различают 5 степеней активности окиси алюминия. Наиболее активную (сухую) окись алюминия получают прокаливанием при 400-450 С. В колоночной хроматографии обычно используют основную (рН 9,0-10,0) и нейтральную окись алюминия. На ней хорошо разделяются спирты, углеводороды, стероиды, алкалоиды, природные пигменты, витамины и сложные эфиры. Надо иметь в виду, что окись алюминия может инициировать многие реакции (конденсации, полимеризации и др.). При использовании окиси алюминия нельзя применять в качестве элюентов ацетон и этилацетат.

Свойства магнезии (окиси магния) сходны со свойствами окиси алюминия, однако магнезия более эффективна для разделения ненасыщенных соединений. Ее часто используют для разделения витаминов, стероидов, алкалоидов, сложных эфиров.

Активированный древесный уголь пригоден для разделения углеводов, пептидов, аминокислот. Он избирательно сорбирует ароматические углеводороды.

Растворители располагают в ряд по их элюирующей способности; обычно элюирующая способность соответствует величине диэлектрической проницаемости растворителя. Можно привести следующий ряд растворителей по уменьшению их элюирующей способности: органические кислоты, пиридин, вода, метанол, этанол, пропанол, ацетон, дихлорэтан, этилацетат, хлороформ, диэтиловый эфир, бензол, четыреххлористый углерод, циклогексан, гексан. При использовании в качестве сорбента активированного угля этот ряд обращается.

В отличие от описанного ранее (см. с. 119) метода элюирование можно прекратить, как только фронт растворителя достигнет конца колонки. После этого весь столбик сорбента аккуратно выталкивают из колонки и определяют зоны расположения индивидуальных компонентов (по окраске, свечению при облучении УФ-лампой или после обработки специальным реагентом, образующим с компонентами смеси окрашенные соединения).

Отношение пути, пройденного зоной определяемого компонента, к пути, пройденному фронтом растворителя, обозначается и является важной характеристической величиной. Большое число значений Rf включено в справочники по хроматографии, их знание облегчает идентификацию компонентов исследуемого образца.

К недостаткам адсорбционной колоночной хроматографии относится длительность элюирования.

В отличие от адсорбционной распределительная колоночная хроматография напоминает противоточную экстракцию. Она основана на распределении растворенных веществ между подвижной органической фазой и водной фазой, удерживаемой твердым носителем. Носитель должен быть инертен по отношению к разделяемым веществам, но должен хорошо удерживать неподвижную жидкую фазу. Обычно применяемые носители (силикагель, кизельгур, целлюлоза) удерживают 0,5-1 мг жидкой фазы на 1 г собственной массы. В качестве неподвижной жидкой фазы чаще всего используют воду. При разделении веществ, хорошо растворимых в органических растворителях, часто поступают наоборот: твердый носитель пропитывают органическим растворителем, а в качестве подвижной жидкой фазы используют воду.

Колоночной распределительной хроматографией удобно пользоваться для препаративного выделения чистых веществ.

Как уже отмечалось, основным недостатком колоночной хроматографии является длительность разделения. Время хроматографирования можно уменьшить, если использовать тонкослойную или бумажную хроматографию.